HPLC 法同時測定金雀花中6 種黃酮類成分

布比阿加爾·哈依拉提，秦亞迪，王 宇，沈 靜，姚 軍*，程煜鳳*

（1.新疆醫科大學藥學院，新疆烏魯木齊 830011； 2.新疆醫科大學第五附屬醫院藥劑科，新疆 烏魯木齊 830011）

金雀花Caragana sinicaRehd.為豆科蝶形花亞科錦雞兒屬植物的成熟干燥花［1］，分布于我國新疆、廣西、湖北等地［2-3］。金雀花化學成分包括黃酮類、二苯乙烯類、萜類等［4］，具有活血、補血、健脾等功效［5］，其中黃酮類成分具有治療高血壓的功效［6］。

通過薄層色譜法（TLC）定性分析新疆金雀花，發現其含有槲皮素、山柰酚及異鼠李素等黃酮類成分，并通過液相色譜法（HPLC）測定其含量［7］。迪里木拉提等［8］建立金雀花藥材中蘆丁和山柰酚-3-O-蕓香糖苷HPLC 含量測定方法。袁潔等［9］通過液相色譜-靜電場軌道肼高分辨質譜方法對新疆金雀花黃酮類純化物進行分析，鑒定出21個黃酮類化合物，對這21 個黃酮類化合物進行分析，發現其中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-半乳糖苷等成分含量較高，可作為金雀花中黃酮類化合物的指標性成分。本研究采用HPLC 法對以上6 種黃酮類化學成分進行含量測定，并通過多元統計分析方法分析了3 種產地金雀花樣品中這6 種成分的含量差異，以期為金雀花藥材質量標準的建立及藥材質量評價提供參考。

1 材料

安捷倫高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；AB135-S 分析天平（瑞士Mettler-Toledolo 公司）；KQ-500DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；N-1001 型旋轉蒸發儀（上海愛郎儀器有限公司）。

蘆丁（批號20231101）、金絲桃苷（批號20230820）、異槲皮苷（批號20230319）對照品均購自北京索萊寶科技有限公司；山柰酚-3-O-蕓香糖苷（批號P2041843）對照品購自上海同田生物科技有限公司；水仙苷（批號P2034361）對照品購自上海詩丹德生物科技有限公司；異鼠李素-3-O-半乳糖苷（批號B21555）對照品購自上海源葉生物科技有限公司。乙腈、甲醇、甲酸為色譜純；水為純水。

9 批藥材為新疆、四川、廣西等3 個產地的3個不同批次藥材，均購自烏魯木齊市各大藥材市場，按產地批次不同進行編號，依次為XJ01～XJ03（產自新疆）、SC01～SC03（產自四川）、GX01～GX03（產自廣西），均由新疆醫科大學藥學院帕麗達·阿不力孜教授鑒定為豆科錦雞兒屬植物金雀花Caragana sinicaRehd.的干燥成熟花。

2 方法

2.1 對照品溶液 精密稱取蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-半乳糖苷各對照品適量于10 mL 量瓶中，用甲醇配制成質量濃度分別為1.004、1.008、1.001、1.010、1.005、1.009 mg／mL 的對照品貯備液。移取適量各對照品貯備液于10 mL 量瓶中，用甲醇定容，搖勻，制成每1 mL 含有上述各成分分別為 0.040、0.080、0.140、0.120、0.150、0.040 mg 的對照品溶液，即得。

2.2 供試品溶液 精密稱取金雀花藥材（過5 號篩）約1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，超聲提取50 min，合并濾液，50 ℃旋轉蒸發，用甲醇定容于10 mL 量瓶中，搖勻，即得。

2.3 色譜條件 Agilent 5 TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1% 甲酸（B），梯度洗脫（0～5 min，83%～82% A；5～11 min，82%～80%A；11～16 min，80%～79%A；16～25 min，79%～78% A；25～30 min，78%～77% A；30～37 min，77%～83%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長254 nm；進樣量10 μL。

2.4 專屬性考察 精密吸取“2.1”“2.2” 項下溶液各10 μL，在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，記錄色譜圖，見圖1。結果表明，供試品溶液色譜圖與對照品溶液色譜圖在相應位置上，有相同保留時間的色譜峰，而空白溶劑則沒有，且在該條件下，各峰間分離度均大于1.5，其他成分對待測成分色譜峰的測定無干擾，理論塔板數以蘆丁峰計不低于3 000，說明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5 線性關系考察 精密量取“2.1” 項下對照品溶液0.1、0.5、2.0、3.0、4.0 mL 于10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，以各成分質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表1。結果表明，對照品溶液中6 種成分在各自范圍內線性關系良好。以信噪比為3∶1 和10∶1 時的質量濃度分別作為檢測限和定量限，結果見表1。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6 精密度試驗 精密吸取“2.1” 項下對照品溶液10 μL，在“2.3” 項色譜條件下連續進樣測定6 次，測得蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-半乳糖苷峰面積RSD 分別為1.95%、1.35%、2.33%、2.05%、2.31%、1.99%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗 取金雀花樣品（GX01）適量，按“2.1” 項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、16、24 h 在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，測得蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-半乳糖苷峰面積RSD 分別為2.45%、2.17%、1.67%、0.81%、1.78%、1.37%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.8 重復性試驗 精密稱取同一批金雀花樣品（GX01）6 份，每份約1 g，按“2.1” 項下方法平行制備供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，測得蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-半乳糖苷的平均含量分別為0.012%、0.007%、0.023%、0.209%、0.226%、0.358%，RSD 分別為3.53%、2.69%、3.24%、2.54%、3.75%、2.81%，表 明該方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗 取已知各成分含量的金雀花藥材（GX01）9 份，每份約0.5 g，精密稱定，分別按50%、100%、150%的比例精密加入適量的對照品貯存液，按“2.2” 項下平行制備供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，記錄峰面積，計算平均加樣回收率及RSD，結果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝9）

2.10 樣品含量測定 取不同批次金雀花樣品約1.0 g，精密稱定，每批平行稱取3 份，按“2.1”項下方法平行制備供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，記錄6 種成分峰面積，并計算其含量，結果見表3。

表3 不同產地各成分含量測定結果（mg／g， n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝3）

2.11 聚類熱圖分析 以蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-半乳糖苷含量為評價指標，通過R 語言進行不同產地不同批次金雀花樣品6 種成分含量聚類熱圖分析。聚類熱圖縱向聚類結果代表不同產地樣品間的含量差異關系，橫向聚類結果代表6 種成分間的含量差異關系，熱圖顏色深淺反應各成分含量的高低，結果見圖2。產地聚類分析結果顯示，產地為廣西的樣品聚類為第一類，產地為四川和新疆的樣品聚為第二類。異鼠李素-3-O-半乳糖苷單獨聚為一類，蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷這5 種成分聚為一類，說明蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-半乳糖苷是區分不同產地樣品的差異性成分。比較圖2 中3 個產地樣品的蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-半乳糖苷條帶顏色，發現第一類產地樣品整體條帶顏色偏深，第二類產地樣品整體顏色偏淺，提示第一類產地樣品中這6 種成分含量較第二類產地高，說明不同產地這6 種成分含量存在明顯差異。

圖2 不同產地金雀花6 種成分含量聚類熱圖Fig.2 Cluster thermal map of the contents of 6 components in C.sinica from different origins

2.12 主成分分析 采用R 語言對不同產地的9批樣品進行主成分分析。結果顯示，前2 個主成分的累計貢獻率為96.5%，說明提取的2 個主成分可以反映主要成分含量的大部分信息，主成分得分圖見圖3。結果顯示，相同形狀的樣品聚集在一起，四川產金雀花和新疆產金雀花為第一類，廣西產金雀花為第二類，與聚類熱圖中產地聚類結果基本相同。主成分分析結果與熱圖聚類分析結果相互印證，進一步說明聚類熱圖的分析結果較可靠，即不同產地這6 種成分含量存在明顯差異。

圖3 不同產地金雀花主成分得分圖Fig.3 Principal component score chart of C.sinica from different origins

3 討論

本研究提取方法參考課題組前期研究［10］，檢測方法分別以甲醇-0.1% 甲酸、甲醇-0.1% 磷酸、乙腈-0.1%甲醇為流動相，以等度及梯度洗脫的方式，以20、25、30 ℃為柱溫、采用COSMOSIL 5C18-AR-Ⅱ、INERTSIL ODS-3、Agilent 5 TC-C18為色譜柱等進行篩選，以分離度、峰型及基線噪音為指標進行綜合考察，最終確立金雀花藥材中6 種化學成分含量測定的HPLC 方法。

蘆丁具有抗炎、鎮痛、抗氧化的藥理作用［11-12］；金絲桃苷具有提高抗氧化酶活力，增加機體免疫功能的藥理作用［13-14］；異槲皮苷具有抗腫瘤、降血壓、調血脂等藥理作用［15-16］；山柰酚-3-O-蕓香糖苷具有保肝、抗肝毒性、保護神經等藥理活性［17］；水仙苷具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用［18］；異鼠李素-3-O-半乳糖苷具有抗炎、鎮痛等藥理作用［19］；因此，本研究以蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷及異鼠李素-3-O-半乳糖苷為含量測定指標。

含量測定結果顯示新疆產的金雀花6 種化學成分含量批間差異較小，而廣西及四川產的批間差異較大，可能是受采集年限、貯存條件等因素影響；不同產地的金雀花6 種化學成分含量有一定的差異性。因此，本研究建立的HPLC 法同時測定金雀花中6 種化學成分含量，可為金雀花藥材質量標準的建立及藥材質量評價提供參考。