基于熵權法和灰色關聯度法的鐵皮石斛質量評價

王柳瓔，郭煥佳，姬生國

（廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510000）

鐵皮石斛來源于蘭科石斛屬鐵皮石斛Dendrobium officinaleKimura et Migo.的干燥莖，具有益胃生津、滋陰清熱作用［1］，分布于我國安徽、浙江、云南等地［2］。2020 年版《中國藥典》 規定鐵皮石斛的質量評價指標為多糖和甘露糖，其中多糖含量不得少于25%，甘露糖含量為13%～38%。鐵皮石斛多糖具有抗腫瘤［3-4］、降血壓［5］、降血糖［6］、降血脂［7］作用，而甘露糖是鐵皮石斛多糖組成的主要單糖，對腫瘤、糖尿病、肥胖病都具有治療作用［8-9］。隨著人工栽培技術的成熟，鐵皮石斛的種植面積開始擴大，不同產區栽培的鐵皮石斛質量存在差異。目前采用傳統經驗鑒別或建立藥材指紋圖譜等方法對鐵皮石斛質量進行評價，不夠全面［10］。灰色關聯分析是多種因素統計分析的一類方法，它是以各因素的樣本數據為依據，用灰色關聯度來衡量各因素間關聯性大小［11］。本研究采用熵權法和灰色關聯度法相結合的質量評價模型，以鐵皮石斛多糖、甘露糖的含量、水分、總灰分和醇溶性浸出物作為評價指標進行研究。

1 材料

1120 型高效液相色譜儀、BIY211b 萬分之一電子天平、AY120 十萬分之一電子天平（日本島津公司）；UV1102 型紫外可見分光光度計（上海天美股份有限公司）；DELTA D150 型超聲清洗器（上海旦鼎國際貿易有限公司）。

20 批鐵皮石斛樣品為2020 年7 月至8 月期間采自廣東省、湖南省、四川省等栽培基地，詳見表1，經廣東農科院環藝所王再花副研究員鑒定為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛Dendrobium officinaleKimura et Migo。除去鐵皮石斛葉，莖經105 ℃殺青15 min，60 ℃干燥后粉碎，過50 目篩，保存在自封袋中，置于干燥器中備用。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

無水葡萄糖（批號110833-202005）購于中國食品藥品檢定研究院；甘露糖（批號140651-202002）購于中國藥品生物制品檢定所。甲酸、乙腈、乙酸銨為色譜純；其他試劑均為分析純；水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 多糖含量測定 精密稱取無水葡萄糖0.100 0 g，用水溶解并定容至100 mL。取10 mL 溶液至100 mL量瓶，用水稀釋至刻度，制成質量濃度為100 μg／mL 的對照品溶液。

精密稱取樣品0.300 0 g，加入200 mL 水，加熱回流提取2 h，放冷，提取液轉移至250 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過。精密量取2 mL 續濾液，置于15 mL 離心管中，精密加入無水乙醇10 mL，充分搖勻，置于4 ℃冰箱中冷藏1 h，離心20 min，棄去上清液，沉淀物用80% 乙醇洗滌2次，每次8 mL，離心，沉淀物加水溶解后轉移至10 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

精密量取多糖對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，置于10.0 mL 具塞試管中，加蒸餾水至1.0 mL，精密加入1 mL 5%苯酚溶液，搖勻，加入濃硫酸5.0 mL，于95 ℃水浴加熱20 min。以1.0 mL 蒸餾水作為空白對照，于488 nm 波長處測定，以質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（Y）進行回歸，得回歸方程為Y＝ 0.008 737X＋0.005 2，r＝0.999 6。結果表明多糖在10～80 μg／mL范圍內線性關系良好。

精密量取供試品溶液0.4 mL 置于10 mL 具塞玻璃試管中，加水至1.0 mL 后測定。

2.2 甘露糖含量測定 色譜條件為ODS-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.02 mol／L乙酸銨（20∶80），等度洗脫；檢測波長250 nm；體積流量1 mL／min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。

精密稱取10 mg 甘露糖，置于100 mL 量瓶中，用水溶解并定容，制成質量濃度為100 μg／mL 的甘露糖對照品溶液。

精密稱取樣品粉末0.120 0 g，置于索氏提取器中，加入25 mL 80% 乙醇，加熱回流提取4 h，棄去乙醇，將粉末取出揮干溶劑，置于具塞錐形瓶中，加入100 mL 水，加熱煎煮1 h，放冷，用水補足至100 mL，離心，吸取上清液1 mL 置于具塞玻璃管中，加入0.5 mL 3.0 mol／L 鹽酸，封口，混勻，置于沸水浴中水解1 h，放冷，用3.0 mol／L氫氧化鈉調節pH 至中性。吸取400 μL，加入0.5 mol／L 1-苯基-3-甲基-5 吡唑啉酮甲醇溶液和0.3 mol／L 氫氧化鈉溶液各400 μL，充分混勻，70 ℃水浴反應100 min，放冷，加入500 μL 0.3 mol／L鹽酸，混勻。用三氯甲烷洗滌3 次，棄去三氯甲烷層，水層離心后吸取其上清液，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

精密吸取對照品溶液 25.000、10.000、2.500、1.250、0.625、0.500、0.250、0.150 mL，分別置于100 mL 量瓶中定容，測定甘露糖的峰面積，以對照品溶液質量濃度為縱坐標（X），峰面積為橫坐標（Y）進行回歸，得回歸方程為Y＝9 798.398 9X＋1.105 1，r＝0.999 9，在0.15～25 μg／mL 范圍內線性關系良好，色譜圖見圖1，結果見表2。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3 指標成分的測定 參照2020 年版《中國藥典》 通則0832 水分測定法中的第二法“烘干法”、通則2302 灰分測定法中的總灰分測定法及通則2201 項下醇溶性浸出物測定法中的熱浸法對鐵皮石斛中水分、總灰分、醇溶性浸出物進行含量測定，結果均符合藥典規定，見表2。

表2 各成分含量測定結果Tab.2 Results of content determination of various constituents

2.4 熵權法計算權重 設有n個樣品，每個樣品有m項評價指標，由此組成單元序列｛Xij｝（i＝1、2、3……n；j＝1、2、3……m；n為20，m為5）［12-13］。

2.4.2 各指標的信息熵 計算各個指標的信息熵Ej，公式為式中Ej為樣品第j個指標的信息熵，若Pij＝0，則定義ln（Pij）＝0。

2.4.3 確定各指標權重 確定各指標的信息熵后，計算各指標的權重（Wj），公式為Wj ＝。結果見表3。

表3 信息熵及權重Tab.3 Information entropies and weights

2.5 灰色關聯度法計算各指標相對關聯度 設有n個樣品，每個樣品有m項評價指標，由此組成單元序列 ｛Xik｝（i＝1、2、3……n；k＝ 1、2、3……m；n為20，m為5），從質量評價的角度出發，水分和總灰分越低越好，多糖和甘露糖含量越高越好，對水分和總灰分兩個指標的數據進行倒數轉換［14］，評價指標統一后，將n個樣品各項對應指標的最大值｛Xsk｝ 計為最優參考序列，n個樣品各項對應指標的最小值｛Xtk｝ 計為最差參考序列。

2.5.2 關聯系數計算 采用相應公式計算相對于最優參考序列｛Xsk｝ 和最差參考序列｛Xtk｝的關聯系數［15］，，式中Δmin＝min｜Yik－Ysk｜；Δmax＝max｜Yik－Ysk｜；i＝1，2，3，…，n；k＝1，2，3，…，m；ρ稱為分辨系數，此次取值為計算獲得的各項指標的權重。結果見表4。

表4 各評價單元的關聯系數Tab.4 Correlation coefficients for each evaluation unit

2.5.3 關聯度計算 分別采用相應公式計算相對于最優參考序列｛Xsk｝ 和最差參考序列｛Xtk｝的關聯度，

2.5.4 相對關聯度的計算 按公式計算各評價單元的相對關聯度，，式中i ＝1，2……n。

根據相對關聯度的大小對評價單元序列進行排序，最終得到優劣評價結果。結合熵權法結果，各樣品的相對關聯度結果見表5。

表5 不同批次鐵皮石斛相對關聯度Tab.5 Relative correlation degrees of different batches of D.officinale

2.5.5 鐵皮石斛的質量排序 對鐵皮石斛多糖、甘露糖含量、水分、總灰分及醇溶性浸出物結果進行排序［16］，并使用灰色關聯度法及熵權法結合灰色關聯度法對20 批不同產地鐵皮石斛進行質量排序，結果見表6。

表6 不同批次鐵皮石斛質量排序Tab.6 Quality ranking for different batches of D.officinale

3 討論

本研究構建熵權法結合灰色關聯度法評價鐵皮石斛質量模型，結果表明不同批次的鐵皮石斛藥材樣品之間的相對關聯度在0.228 2～0.496 0，說明不同產地之間存在質量差異，其中S1～S10 樣品采集于廣東省廣州市栽培基地，各樣品之間最小相對關聯度為0.244 7，最高相對關聯度為0.373 4。結果表明，樣品采集于相同產地，但由于栽培環境、培植方法及養護方法等的不同，對鐵皮石斛藥材的質量會造成一定影響。

對樣品排序及以灰色關聯度法和以熵權結合灰色關聯度法進行分析，樣品S3 中總灰分及甘露糖含量均排第一，其在灰色關聯度分析及綜合分析評價中均排在第六；樣品S12 中水分含量排第一，其在灰色關聯度分析及綜合分析評價中均排在第二十；樣品S13 中多糖含量排第一，其在灰色關聯度分析及綜合分析評價中均排在第四；樣品S16 在灰色關聯度分析及綜合分析評價中均排第一。水分和總灰分的含量越高其質量越差，相反醇溶性浸出物、多糖和甘露糖含量越高其質量越優。但是灰色關聯度法分析結果和熵權結合灰色關聯度法分析的綜合評價排序不一致，是因為灰色關聯度法中各指標的ρ一直采用的是經驗值0.5，即各指標權重相同，無法體現各個指標對整體質量的影響程度，在質量評價上并不能做到客觀全面［17-18］。結合熵權法以后，以熵值來判斷某個指標的離散程度，信息熵值越小，指標的離散程度就越大，則該指標對綜合評價的影響（即權重）就越大［19］。經熵權法獲得鐵皮石斛中水分、灰分、浸出物、多糖、甘露糖含量的熵值分別為0.825 9、0.842 7、0.723 7、0.766 9、0.796 5。多糖及甘露糖含量的熵值較小，說明這2 種指標的含量對藥材質量影響的權重最大。

本研究以水分、灰分、浸出物、多糖、甘露糖含量為指標，通過熵權結合灰色關聯度法對鐵皮石斛藥材質量進行綜合評價分析，相對于單一指標的評價較為科學，為建立科學、可靠的鐵皮石斛藥材質量評價體系提供了參考。