親和超濾-液質聯用技術在天然產物活性成分篩選中的研究進展

張文光，馬智慧，孟文文，劉慧茹，趙東升，鄧志鵬，劉江亭，趙 盼

（山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250300）

天然產物是自然界生物歷經幾千年進化保留下來的初級或次級代謝產物，研究表明1981 年至2019 年全球上市的藥物有64.9%來自于天然產物［1］。從天然產物中篩選得到的活性物質結構新穎、療效好、不良反應少，鑒于其多樣的生物活性和化學結構，既可以直接開發為新藥，也可以作為先導化合物進行結構修飾與優化后成為新藥［2］。目前對天然產物進行化學分離、結構鑒定、有效活性成分篩選的方法主要有活性追蹤分離法［3］、柱后生物測定法［4］、前沿親和色譜法［5］等，但存在時間長、勞動強度大、專屬性差、微量活性組分不易檢測、活性成分易丟失等問題，嚴重阻礙了探尋天然產物中活性成分的步伐。因此，如何從天然產物中快速高效地篩選活性成分，是研究重點。

現代藥理學研究表明，藥物與生物大分子的親和性是其發揮作用的第一步［6］，因此，基于與疾病相關的生物大分子作為靶標進行藥物篩選的分子靶向法應運而生。親和超濾-液質聯用（AUF-LC-MS）技術是基于溶液的親和性選擇平臺，采用超濾方法分離溶液中的目標配體復合物，是從復雜天然產物中鑒定活性分子的有力工具。1997 年van Breemen 等［7］使用血清白蛋白和腺苷脫氨酶作為生物分子靶標，首次把液相色譜和電噴霧質譜技術聯用篩選天然產物中的活性成分。親和超濾技術應用于天然產物活性成分篩選，不但克服了傳統篩選方法的缺點，可使天然活性成分的篩選與結構鑒定一步完成，而且能夠有效避免微量活性物質的漏篩和雜質干擾，可提高篩選結果的準確率，現已廣泛用于中藥活性成分研究［8］。

1 流程、原理、應用優勢

AUF-LC-MS 技術已成為受體-配體相互作用研究的通用方法，并在挖掘天然產物活性成分中發揮著越來越重要的作用。其流程為將選定的生物大分子（受體）與待篩選物質（靶標配體）在某一緩沖溶液中進行孵育；然后轉移至合適孔徑的超濾管進行離心超濾，未與生物大分子結合的物質將被離心至超濾管下層；其次用緩沖溶液洗滌未結合的配體小分子；最后將含受體-配體復合物的超濾系統轉移至新的超濾管中，使蛋白變性，解離蛋白，收集下層含有與受體結合的靶標配體成分，隨后用液質聯用技術進行靶標配體的檢測，從而實現天然產物活性成分的快速篩選［9］。其原理流程見圖1。

圖1 AUF-LC-MS 技術篩選天然產物活性成分流程圖

AUF-LC-MS 技術基本原理是基于受體與靶標配體的結合親和力，親和超濾主要分為離心超濾（CU-LC-MS）和脈沖超濾（PU-LC-MS）。目前，離心超濾主要由商品化的超濾離心管實現，由于超濾膜的超低結合和各向異性，整個篩選過程可以通過多次離心洗脫快速完成。脈沖超濾由流動室、磁力攪拌器和超濾膜組成，將測試樣品和目標蛋白加入流動室后，可以通過施加一定的壓力來分離配體-受體復合物和非活性成分，與傳統的篩選方法相比，具有自動化程度高、可反復使用受體的優點。雖然這2 種技術都可以用于親和選擇和配體富集，但它們的應用因設備本身相差較大。例如，離心超濾通常用于篩選活性小分子，而脈沖超濾在描述受體-靶標配體結合特征、藥物代謝、產物測定方面更有效。

AUF-LC-MS 技術是前期處理受體和靶標配體，后期進入在線檢測，利用液質聯用技術進行分析，實驗組的峰強度和峰面積大于對照組，表明化合物特異性結合到目標分子上，這就將高效液相良好的分離能力和質譜的分析能力結合起來。相比于其他篩選檢測方法，具有以下優點，①不需要標記或固定目標或小分子；②以溶液為基礎，并適合于適當的蛋白質折疊和穩定性所必需的不同緩沖液；③選擇性地從復雜混合物中鑒定配體，提供多重篩選平臺；④只需要適量的蛋白質產品。

2 影響因素

2.1 受體與靶標配體濃度 受體與靶標配體濃度是孵育過程中的2 個關鍵因素，為了獲得良好的結合結果，首先對其進行方法學考察。引入了平衡解離常數KD值，受體與靶標配體的KD值應當相差不大，如果相差較大，容易造成假陽性、假陰性結果。受體濃度遠大于配體濃度，易引起非特異性依附，造成假陽性結果；配體濃度遠大于受體濃度，配體中的某些活性成分難以融入蛋白，造成假陰性結果。

2.2 超濾膜 超濾膜的選擇主要涉及2 個方面，①孔徑，對于超濾膜的要求應當是可以截留相應的生物大分子，同時又不會造成漏篩，通常來說孔徑應當小于生物大分子的三分之一；②材料，最為理想的是對于潛在配體和受體沒有特異性吸附作用，最常用的為纖維素類和聚醚砜類。

2.3 緩沖溶液 緩沖溶液貫穿實驗前期準備階段，其pH值對生物大分子影響很大，容易造成生物大分子的變性。理想狀態是可以模擬人體環境，應當選擇與人體pH 值相近的緩沖溶液，在使用過程中也應當注意緩沖溶液的污染問題。

2.4 解離液 能否在整個受體-靶標配體體系中解離出特定的活性成分對實驗結果至關重要，解離液的選擇是關鍵因素，一般選擇有機溶劑作為解離液，例如純甲醇使蛋白變性，將配體與受體解離開。

2.5 其他 除上面幾項關鍵因素，孵育過程中離心管是否無酶、孵育溫度、時間、離心速度、時間等影響因素均為干擾因素，需要進行方法學考察，以確保實驗結果的準確。

3 應用

最近藥理學研究表明，大多數藥物通過與疾病相關的藥物靶點（如酶和受體）相互作用發揮作用［10］。天然產物通常以其復雜的化學成分和多樣化的生物功能為特征。因此，發現生物活性成分并進一步闡明其可能的作用機制是研究天然產物的2 個關鍵環節。AUF-LC-MS 結合了靶向生物分子的親和超濾和液相色譜質譜強大的分離分析能力，可以實現高通量篩選和快速鑒定復雜天然產物中的生物活性成分。在親和超濾過程中，將配體-受體復合物從未結合的化合物中分離出來，隨后通過質譜分析進行定性。在這方面，質譜法不僅可以為新藥發現提供新的思路和方法，而且有助于揭示生物活性成分的作用機制，由其液質檢測靈敏度高、分子量范圍跨度大，在復雜、微量、未知的天然產物得到靈活應用，擴大了親和超濾篩選的范圍。此技術在小分子藥物發現、中藥成分分析、活性成分追蹤等方面均有較好應用，尤其是對于中藥復方制劑來說，發揮作用的可能不是單一成分，而是多種成分產生協同作用的結果，應用AUF-LC-MS 技術便可快速的定位具體中藥、定位具體成分，是研究中藥藥效物質基礎的有效途徑。

3.1 天然產物的高通量篩選 該技術可用于篩選包括α-葡萄糖苷酶［11］、黃嘌呤氧化酶（XOD）［12］、乳酸脫氫酶［13］、酪氨酸酶［14］等的潛在配體。Li 等［13］采用超濾高效液相色譜-光電二極管陣列檢測-電噴霧電離質譜聯用技術對射干提取物中的異黃酮進行篩選，鑒定射干中的鳶尾苷、鳶尾苷A、鳶尾苷等為乳酸脫氫酶抑制劑。Ning 等［15］運用親和超濾結合超高效液相色譜和四極桿飛行時間質譜技術從青錢柳葉提取物中鑒定出特定的α-葡萄糖苷酶抑制劑，并從青錢柳葉提取物中鑒定出11 種潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑，體外α-葡萄糖苷酶抑制實驗證實，槲皮素、山柰酚等提取物是α-葡萄糖苷酶抑制活性的主要成分。Liu 等［16］采用AUF-LC-MS 法對丹參提取物中潛在的XOD 抑制劑進行篩選和鑒定，從提取物中鑒定出11 種親脂性二萜奎寧為XOD抑制劑。Xie 等［17］成功建立了基于5-LOX／COX-2 酶親和力的生物活性化合物鑒定和篩選的AUF-LC-MS 方法，從知母提取物中獲得5 個生物活性化合物，為后續多靶點藥物篩選提供參考。詳見表1。

表1 親和超濾技術篩選天然產物活性成分表

續表1

續表1

3.2 中藥復方制劑中潛在活性成分篩選 Zhang 等［78］以α-葡萄糖苷酶為例，建立超濾液相色譜-四極桿飛行時間質譜快速鑒定參芪降糖顆粒中生物活性成分的方法，從篩選單一天然產物中的活性成分推及到中藥復方制劑，篩選出的α-葡萄糖苷酶抑制劑候選藥物為開發和設計高效抗糖尿病藥物的應用提供參考。詳見表2。

表2 親和超濾技術篩選復方制劑活性成分表

3.3 天然產物代謝途徑分析和評價藥物的代謝穩定性 對通過AUF-LC-MS 技術篩選得到的活性成分進行體外代謝研究，從而推斷出可能的代謝途徑。Huang 等［87］采用AUFLC-MS 技術對防風中LOX 抑制劑進行篩選，成功鑒定得到升麻素苷、5-O-甲維阿斯米醇、亥茅酚苷和亥茅酚，利用其有效成分對CYP450 的代謝進行研究，獲得3 種染色質可能的代謝途徑。AUF-LC-MS 聯合其他技術不僅可篩選天然產物中LOX 抑制劑，還可以推斷可能的代謝途徑。Young等［88］運用脈沖超濾技術將細胞素P450 酶和8 種β 阻斷藥物進行混合分析，可以通過與孵育過程中其他化合物的比較來評估每個化合物的相對代謝穩定性。這種方法可能適用于根據代謝穩定性對藥物先導物的定向庫進行排序，為進一步天然產物的開發選擇先導化合物。

AUF-LC-MS 技術具有可提供藥物靶標和化合物之間的高通量結合信息的優點，適用于組成復雜的天然產物提取物，還能與分子對接、網絡藥理學等新興技術聯合應用，進一步驗證配體-受體結合位點。鑒定有效的酶抑制劑／激動劑作為候選藥物已經成為醫學和生物學研究的重要目標之一［4］。總結來看，未來的研究方向為①某種酶發揮抑制作用研究較多，發揮激動作用的研究不足百分之一；②國內外對某一個天然產物研究的較多，大多集中在中藥方面，對復方制劑、代謝產物的研究較少，還處在起步階段；③由于天然產物成分的復雜性，某單一的活性成分是否可以和多個靶標相互作用還有待研究；④就某一個天然產物單靶標研究的較多，對于多靶標的探索還有待增加。

4 結語與展望

天然產物中有效成分的快速篩選是新藥研發的重要一環，篩選的方法有親和超濾-液質聯用技術、磁性微球垂釣法、細胞膜親和色譜法、固定化酶法、在線生物測定法［4］等。AUF-LC-MS 技術相對于其他篩選方法來說具有篩選速度快、結果準確性高、有效避免微量活性物質的漏篩和雜質干擾等優點，然而也有非常突出的局限性，比如小分子與靶標的非功能位點結合或超濾膜的非特異性結合導致假陽性結果等。解決方法是將正常酶變性作為對照，進入液質進行檢測，比較化合物與正常和變性酶的峰面積，以排除假陽性結果。同時，酶活性實驗和分子對接技術排除了許多潛在的非特異性結合化合物，有效地提高了親和超濾-液質聯用技術篩選的準確性和效率。

從目前來看，AUF-LC-MS 技術雖然可以快速地篩選出特定的化合物，但仍面臨許多挑戰，例如親和超濾-液質聯用從天然產物中篩選活性成分方面仍然主要針對1 個或2個靶標，關于多靶標篩選的報道很少，而發現多靶標抑制劑／激動劑更能滿足現代醫學的要求。同時，高通量液質聯用篩選多種蛋白質靶標的技術也有望在不久的將來實現。

綜上所述，無論是為了藥物的發現還是為了更好地理解一系列人類疾病的發病機制，探索更多未知疾病相關蛋白質靶點，都對AUF-LC-MS 技術提出了更高的要求，相信該技術將在進一步研究天然產物中活性成分的篩選發揮更重要的作用。