大黃蒽醌羥丙基-β-環糊精包合工藝優化

陳俊沲，余 平，楊佳力，萬浩芳，張雙雙，石森林*

（1.浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310053； 2.浙江省立同德醫院，浙江 杭州 310012）

大黃始載于《神農本草經》，為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.、唐古特大黃Rheum tauguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum offciualeBaill.的干燥根及根莖，具有清熱瀉火、活血祛瘀的作用［1］，其主要活性成分為蒽醌類衍生物，分為游離型蒽醌與結合型蒽醌，其中前者包括大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃酸等，具有較好的抗炎、抗腫瘤作用［2-3］。但大黃蒽醌的水溶性差，口服生物利用度低，從而限制了該成分應用［4-5］，目前主要通過將其制成脂質體、聚合物膠束、固體脂質納米粒等制劑來改善在水中的溶解度，但存在工藝復雜、制備過程中會引入有毒試劑等問題［6］。

包合物是一種工藝簡單、安全可靠的制劑，其中羥丙基-β-環糊精具有很好的水溶性［7-9］，將藥物包合于其中能顯著增加其溶解度，提高生物利用度，但它受諸多因素的影響，僅根據單一指標難以篩選出最優制備工藝。層次分析法是一種將復雜問題中的各個因素劃分為相互聯系的有序層次，再確定權重系數的方法［10-11］，適用于大黃蒽醌包合物制備工藝的研究。本實驗優化大黃蒽醌羥丙基-β-環糊精包合工藝，以增加其在水中的溶解度，以期為大黃蒽醌的制劑研究提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器 Nicolet IS50 紅外分光光度計，購自美國賽默飛世爾科技公司；ZF-I 型三用紫外分析儀，購自上海顧村電光儀器廠；S-3000N、E-1010 掃描電子顯微鏡，購自日本日立公司；XRD-6100 X 射線衍射儀，購自日本島津公司；Agilent1200 series 高效液相色譜儀，購自美國Agilent 公司；CP313 電子天平，購自奧豪斯儀器（上海）有限公司；XS105 電子分析天平，購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KH-250DB 數控超聲波清洗器，購自昆山禾創超聲儀器有限公司；SHB-III 循環水式多用真空泵，購自鄭州長城科工貿有限公司；DF-101S 集熱式磁力攪拌器，購自鞏義市予華儀器有限公司；RE-3000 旋轉蒸發儀，購自上海亞榮生化儀器有限公司；DNG-5070A 電熱恒溫鼓風干燥箱，購自上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 試劑與藥物 大黃蒽醌原料藥（實驗室自制，純度＞50%）。大黃素（批號110756-200110）、大黃酚（批號110796-200716）對照品，購自中國食品藥品檢定研究院；大黃酸（批號 T20A8F42628）、蘆薈大黃素（批號T28D6F8264）、大黃素甲醚（批號T26A8F34784）對照品及羥丙基-β-環糊精（批號Z13N11Y130870），購自上海源葉生物科技有限公司。乙酸鎂（批號080101），購自上海泗崟化工有限公司。甲醇（批號20210605）、無水乙醇（批號20200811）為色譜純，購自廣東光華科技股份有限公司；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 包合物制備 按1∶40 比例稱取適量大黃蒽醌與羥丙基-β-環糊精，分別用無水乙醇、純化水完全溶解，置于磁力加熱攪拌器上，包合一定時間后靜置，在50 ℃下旋轉蒸發除去乙醇，0.45 μm 微孔濾膜過濾，置于50 ℃水浴鍋上蒸干后移到50 ℃真空干燥箱中干燥，即得。

2.2 包合率、得率測定 精密稱取適量包合物，甲醇溶解，超聲處理30 min，混勻后定容至10 mL，0.22 μm 微孔濾膜過濾，分別采用課題組前期建立的HPLC 法、醋酸鎂-甲醇溶液顯色法測定峰面積、吸光度，計算包合率、得率，公式分別為

2.3 權重系數確定 在制備包合物時，需同時考慮包合率、得率等指標，由于大黃蒽醌包含多個游離型蒽醌，故選擇任何1 個單一指標均無法得到最優制備工藝，但同時選擇多個指標時又會產生沖突。因此，本實驗基于評價包合工藝的關鍵指標，以及各游離蒽醌藥效活性與含量等綜合因素之間的關系［12-14］，以蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃總蒽醌包合率、包合物得率為權重指標并予以量化，再通過YAAHP 軟件中的1～9 標度法對其進行兩兩比較以評判重要性，構建成對比較的判斷優先矩陣，賦予各項指標間的相對評分［15-16］，具體見表1～2。

表1 各指標評分標準

根據表2 結果，采用層次分析法計算各指標權重系數，結果見表3。隨機一致性比率CR ＝CI／RI，當CR＜0.1 時，判斷矩陣具有滿意的一致性及權重計算正確性［17-19］，表3顯示CR 為0.068 0，表明權重系數有效。

表2 各指標成對比較的優先判斷矩陣

表3 各指標權重系數

最后計算綜合評分，公式為綜合評分＝（蘆薈大黃素包合率／最大值×0.038 5＋大黃素包合率／最大值×0.038 5＋大黃酚包合率／最大值×0.115 4＋大黃素甲醚包合率／最大值×0.053 4＋大黃總蒽醌包合率／最大值×0.379 9＋包合物得率／最大值×0.379 9）×100。

2.4 單因素試驗

2.4.1 大黃蒽醌與羥丙基-β-環糊精比例 分別按1∶10、1∶20、1∶40 比例稱取適量大黃蒽醌與羥丙基-β-環糊精，按“2.1” 項下方法制備包合物，按“2.2” 項下方法測定包合率、得率，結果見表4。由此可知，當大黃蒽醌與羥丙基-β-環糊精比例為1∶40 時，包合率、得率、綜合評分較高，可能是由于包合物形成主要依靠羥丙基-β-環糊精與藥物的包合作用，而前者越大可使后者被包合的量也越多，但考慮到成本、輔料用量等問題，兩者比例并非越大越好。因此，選擇大黃蒽醌與羥丙基-β-環糊精比例為1∶40。

表4 大黃蒽醌與羥丙基-β-環糊精比例對包合率、得率的影響（n＝3）

2.4.2 包合溫度 分別在包合溫度30、40、50、60 ℃下按“2.1” 項下方法制備包合物，按“2.2” 項下方法測定包合率、得率，結果見表5。由此可知，當包合溫度為60 ℃時，包合率降低，導致綜合評分呈下降趨勢，不利于包合物制備，可能與大黃蒽醌熱穩定性有關。因此選擇包合溫度為30～50 ℃。

表5 包合溫度對包合率、得率的影響（n＝3）

2.4.3 攪拌速度 分別在攪拌速度100、200、400、600 r／min 下按 “2.1” 項下方法制備包合物，按“2.2” 項下方法測定包合率、得率，結果見表6。由此可知，隨著攪拌速度增加包合率、得率、綜合評分不斷升高，但在600 r／min 時綜合評分反而降低，可能是由于攪拌速度過快導致藥物無法進入羥丙基-β-環糊精的空穴結構中所致。因此，選擇攪拌速度為100～400 r／min。

表6 攪拌速度對包合率、得率的影響（n＝3）

2.4.4 包合時間 分別在包合時間1、2、4、6 h 時按“2.1” 項下方法制備包合物，按“2.2” 項下方法測定包合率、得率，結果見表7。由此可知，隨著包合時間延長包合率、得率、綜合評分不斷升高，但在6 h 時綜合評分反而降低，可能與大黃蒽醌在溶劑中的穩定性有關，并且時間過長成本也會較大。因此，選擇包合時間為1～4 h。

表7 包合時間對包合率、得率的影響（n＝3）

2.5 正交試驗 在單因素試驗基礎上，選擇攪拌速度（A）、包合溫度（B）、包合時間（C）作為影響因素，綜合評分作為評價指標，采用L9（34）正交表進行試驗，因素水平見表8，結果見表9。

表8 因素水平

表9 試驗設計與結果

方差分析見表10，可知各因素影響程度依次為包合溫度＞攪拌速度＞包合時間。最終確定，最優工藝為A1B3C3，即攪拌速度100 r／min，包合溫度50 ℃，包合時間4 h。

表10 方差分析

按上述優化工藝進行驗證試驗，即按1∶40 比例稱取大黃蒽醌與羥丙基-β-環糊精，分別用無水乙醇、純化水完全溶解，控制包合溫度為50 ℃，攪拌速度為100 r／min，包合時間為4 h，按“2.1” 項下方法制備包合物，按“2.2”項下方法測定包合率、得率，平行3 次，結果見表11。由此可知，該工藝穩定可行，可用于制備大黃蒽醌羥丙基-β-環糊精包合物。

表11 驗證試驗結果（n＝3）

2.6 包合物表征

2.6.1 紅外光譜 取原料藥、羥丙基-β-環糊精、物理混合物、包合物適量，采用KBr 壓片法，設定分辨率為4 cm－1，在4 000～500 cm－1波數處進行分析，結果見圖1。由此可知，包合后1 629.17 cm－1等波數處原料藥吸收峰已經消失或明顯減弱，表明藥物進入羥丙基-β-環糊精空腔，其紅外振動受到限制，包合物成功形成；包合物特征峰與羥丙基-β-環糊精相似，峰形相同；物理混合物紅外圖譜是由吸收較強的羥丙基-β-環糊精紅外圖譜與吸收較弱的原料藥紅外圖譜加和而成，并且與羥丙基-β-環糊精相似，可能是由于物理混合物中也含有大量該輔料所致。

圖1 各樣品紅外光譜圖

2.6.2 X 射線衍射 設定條件為Cu 靶（40 kV，40 mA）；步進掃描0.02°／步；掃描范圍10°～80°；掃描速度2°／min，對羥丙基-β-環糊精、原料藥、物理混合物、包合物進行分析，結果見圖2。由此可知，羥丙基-β-環糊精、原料藥在10°～35°處有多個強結晶特征衍射峰，后者衍射峰與前者差異較大，表明原料藥已被成功包合入羥丙基-β-環糊精的空穴中。

圖2 各樣品X 射線衍射圖

2.6.3 掃描電鏡 取羥丙基-β-環糊精、原料藥、物理混合物、包合物適量，經導電膠粘樣、噴金鍍膜后固定于銅板上，在掃描電鏡下觀察其外觀，結果見圖3。由此可知，羥丙基-β-環糊精呈中空圓球狀；原料藥呈表面粗糙的巨大團塊；物理混合物為中空圓球與粗糙團塊的簡單混合物；包合物為表面光滑的細小顆粒，表明其成功形成。

圖3 各樣品掃描電鏡圖

2.7 平衡溶解度測定 取5 mL 純化水至離心管中，加入過量包合物，置于恒溫振蕩器中，溫度保持（25±1）℃，振搖24 h，7 000 r／min 離心10 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，稀釋適當倍數，進行HPLC 分析，取適量上清液，采用醋酸鎂-甲醇溶液顯色法測定大黃總蒽醌含量，結果見圖4。由此可知，未經包合的原料藥飽和水溶液中未檢出蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚，大黃總蒽醌溶解度僅為（69.25±4.10）μg／mL；包合后，上述4 種成分溶解度分別為（166.78±22.50）、（117.40±11.14）、（31.17±5.71）、（11.08±3.07）μg／mL，出現了明顯色譜峰，大黃總蒽醌溶解度達（399.24±42.93）μg／mL，與包合前相比增加了5.77 倍，表明羥丙基-β-環糊精包合物能有效改善大黃蒽醌水溶性。

圖4 各成分HPLC 色譜圖

3 討論

大黃作為瀉下通腑的代表藥，具有較好的通便導滯、活血祛瘀功效［20］。近年來，大黃蒽醌被不斷開發，新功效也越來越多［21］，但該成分在水中的溶解度低，滲透差，體內生物利用度不理想，從而限制了其臨床應用。目前，有研究通過制備脂質體、聚合物膠束、納米粒等方式來改善大黃蒽醌的水溶性，但存在工藝復雜、需使用有毒試劑等問題［22］，而包合物的制備無需使用有毒試劑，并可大大改善藥物溶解性和理化穩定性［23-24］。由于大黃蒽醌包合物在制備過程中需同時考慮各游離蒽醌的包合率、包合物得率等指標，故采用層次分析法來確定其權重系數。

在單因素試驗過程中，本實驗考察了大黃蒽醌與羥丙基-β-環糊精比例、包合時間、包合溫度、攪拌速度，發現隨著大黃蒽醌與羥丙基-β-環糊精比例不斷增加，包合物綜合評分也不斷升高，但考慮到制劑成本及可行性，最終確定為1∶40。在正交試驗過程中，本實驗考察了包合時間、包合溫度、攪拌速度對包合物制備工藝的影響，最終確定了最優工藝，其操作簡便，穩定可行，適合工業化大生產，也可為后續原料藥開發利用提供參考。然后，采用紅外光譜、X 射線衍射、掃描電鏡對包合物進行表征，發現大黃蒽醌已被包合入羥丙基-β-環糊精空穴中，并且其水溶性明顯改善。

綜上所述，本實驗在單因素試驗基礎上采用正交試驗優化大黃蒽醌羥丙基-β-環糊精包合工藝，可較好地增加該成分水溶性，為其后期應用提供參考，但其生物利用度能否提高尚不明確，仍需作進一步研究。