4 種提取方法對清咽潤喉復方有效成分含量及抗炎鎮(zhèn)痛作用的影響

韓江云，王春龍，李建平劉明華，陳斯瑋，張 丹*

（1.西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，四川 瀘州 646000； 2.西南醫(yī)科大學藥學院，四川 瀘州 646000）

清咽潤喉復方由青龍白虎湯加荷葉而來。青龍白虎湯，出自清代著名醫(yī)家《王氏醫(yī)案》 卷二［1］，由鮮青果、鮮萊菔組成，具有清熱瀉火、解毒利咽、生津止渴的功效，可用于治療慢性咽炎［2］。青果，《本草綱目》 中記載“生津液，止煩渴，治咽喉痛”；現(xiàn)代研究表明，青果中黃酮和沒食子酸均有抗炎、鎮(zhèn)痛作用［3］。萊菔，即蘿卜，為藥食同源中藥，可清熱解毒、理氣寬中；現(xiàn)代研究表明，蘿卜具有清熱生津、化痰止咳等作用［4］。荷葉，可除暈清痰、泄氣、止嘔；現(xiàn)代研究表明，荷葉中生物堿、黃酮類化合物具有抗菌、消炎等功效［5］。

復方現(xiàn)代研究中，醇和水為最常用提取溶劑，不同溶劑性質各異，故同一復方經(jīng)不同溶劑提取，在成分種類、含量等方面也存在明顯差異，將極大地影響復方藥效發(fā)揮。因此，將有效成分和藥效學相結合考察不同提取方法對復方藥效的影響是一個更全面、更科學的考察方法［6］。本研究以清咽潤喉復方為研究對象，通過對比其有效成分含量和抗炎鎮(zhèn)痛效果探究最佳提取方法，以期為開發(fā)安全可靠、服用方便的清咽潤喉相關產(chǎn)品奠定理論基礎和實驗支撐。

1 材料

1.1 試劑與藥物 青果、荷葉購自四川天植中藥股份有限公司，經(jīng)西南醫(yī)科大學生藥學教研室莊元春副教授鑒定為正品，均符合2020 年版《中國藥典》 一部各飲片項下要求；蘿卜、雞蛋清購自瀘州市菜市場。沒食子酸（批號MUST-17022801，純度 99%）、荷葉堿（批號 MUST-17030204，純度98.91%）對照品購自成都曼思特生物科技有限公司；濱蒿內酯對照品（批號Z05D7B26157，純度98%）購自上海源葉生物科技有限公司；二甲苯（批號20150628）購自成都欣正通化工有限公司；地塞米松（批號110310）購自北京百靈威科技有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純，購自成都科隆化學品有限公司；冰乙酸為分析純，購自天津申泰化學試劑有限公司。

1.2 儀器 LC-2030C 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SQP 型電子分析天平（德國Sartorius 公司）；艾柯超純水機（成都唐氏唐寧科技發(fā)展有限公司）。

1.3 動物 SPF 級昆明種小鼠、SPF 級SD 大鼠均由西南醫(yī)科大學動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（川）2018-0017，實驗動物使用許可證號SCXK（川）2018-0063。本研究所有動物實驗操作經(jīng)西南醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準。

2 方法與結果

2.1 提取與測定

2.1.1 提取方法

2.1.1.1 醇提法 將30 g 清咽潤喉復方用10 倍量70%乙醇加熱回流3 次，合并濾液，濃縮至適當體積，即得清咽潤喉復方醇提液。

2.1.1.2 水提法 將30 g 清咽潤喉復方用10 倍量水加熱提取3 次，濃縮濾液至適當體積，即得清咽潤喉復方水提液。

2.1.1.3 醇水雙提法 先將適量青果、荷葉用10 倍量70%乙醇加熱回流3 次，過濾，回收乙醇；另將濾渣與萊菔用10 倍量純水加熱提取3 次，過濾，合并乙醇提取物和水提取物，濃縮至當體積，即得清咽潤喉復方醇水雙提液。

2.1.1.4 揮發(fā)油雙提法 稱取青果、荷葉適量，打成粗粉，置圓底燒瓶中，加10 倍量水，浸泡30 min，按照2020年版《中國藥典》 四部通則2204 揮發(fā)油測定法（甲法）提取，收集揮發(fā)油，濾渣用10 倍量70%乙醇提取3 次，過濾，回收乙醇；濾渣與萊菔加入10 倍量水，加熱提取3次，過濾，合并乙醇提取物和水提取物，濃縮至適當體積，加入揮發(fā)油，即得清咽潤喉復方揮發(fā)油雙提液。

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 供試品溶液 分別量取10 mL “2.1.1” 項下4種提取液，揮干，10 mL 甲醇溶解，置于10 mL 棕色量瓶中，加甲醇定容，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2.2 對照品溶液 精密稱取沒食子酸、濱蒿內酯對照品適量，置于25 mL 棕色量瓶中，加入甲醇溶解，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，制成質量濃度為0.060 9、0.008 2 mg／mL 的混合對照品溶液。精密稱取荷葉堿對照品適量，置于25 mL 棕色量瓶內，加甲醇溶解，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，制成質量濃度為0.010 4 mg／mL的對照品溶液。

2.1.3 色譜條件

2.1.3.1 沒食子酸、濱蒿內酯 參考文獻 ［7］報道，SHIMADZU Shim-pack GIST C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.5% 冰乙酸（B），梯度洗脫（0～5 min，2.5% A；5～21 min，2.5%～27% A；21～30 min，27%～35% A；30～32 min，35%～2.5% A；32～37 min，2.5%A）；體積流量1.0 mL／min；檢測波長271 nm（沒食子酸）、345 nm（濱蒿內酯）；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。理論塔板數(shù)以沒食子酸計不低于3 000；以濱蒿內酯計不低于2 000。

2.1.3.2 荷葉堿 參考文獻［8］報道，SHIMADZU Shimpack GIST C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.1%三乙胺（60∶40）；體積流量0.8 mL／min；檢測波長270 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。理論塔板數(shù)以荷葉堿計不低于2 000。

2.1.4 線性關系考察 取“2.1.2.2” 項下沒食子酸、濱蒿內酯混合對照品溶液以及荷葉堿對照品溶液，分別在“2.1.3” 項色譜條件下進樣2、4、6、8、10、12 μL，以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表1。

表1 各成分線性關系

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.2.2” 項下沒食子酸、濱蒿內酯混合對照品溶液以及荷葉堿對照品溶液10 μL，分別在“2.1.3” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得沒食子酸、濱蒿內酯、荷葉堿峰面積RSD 分別為1.70%、2.00%、0.27%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一份“2.1.2.2” 項下沒食子酸、濱蒿內酯混合對照品溶液以及荷葉堿對照品溶液，于0、2、4、6、12、24 h 在“2.1.3” 項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、濱蒿內酯、荷葉堿峰面積RSD 分別為1.66%、1.00%、1.32%，表明溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復性試驗 取同一批“2.1.2.1” 項下供試品溶液6 份，在“2.1.3” 項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、濱蒿內酯、荷葉堿含量RSD 分別為1.00%、2.80%、1.10%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知供試品溶液，加入適量沒食子酸、濱蒿內酯、荷葉堿的混合對照品溶液，按 “2.1.2.1” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，沒食子酸、濱蒿內酯、荷葉堿加樣回收率分別為104.21%、103.61%、102.53%，RSD 分別為2.38%、2.84%、2.38%。

2.1.9 干膏率測定 精密吸取“2.1.1” 項下所得提取液各25 mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴揮干后，在105 ℃烘箱中干燥3 h，取出置干燥器中，冷卻至室溫后，精密稱定質量至恒重，計算干膏率，結果見表2。

表2 各成分含量測定結果

2.1.10 含量測定 精密吸取“2.1.1” 項下所得提取液適量，在“2.1.3” 項色譜條件下進樣測定，計算4 種提取液中沒食子酸、濱蒿內酯、荷葉堿含量。以青果中沒食子酸含量、濱蒿內酯含量、荷葉中荷葉堿含量、干膏率作為考察指標，權重系數(shù)設置為0.3、0.2、0.2、0.3 進行綜合評分。評分標準中，因沒食子酸、濱蒿內酯和荷葉堿均為方中有效成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛效果，其中沒食子酸在方中含量最高，而中藥是多成分的綜合作用，干膏率又為后續(xù)的成型工藝提供一定的依據(jù)，故綜合評分中二者的權重系數(shù)分別設為0.3，濱蒿內酯和荷葉堿設為0.2，公式為綜合評分＝（A×0.3＋B×0.2＋C×0.2＋D×0.3）×100（A＝?jīng)]食子酸含量／沒食子酸含量最大值，B＝濱蒿內酯含量／濱蒿內酯含量最大值，C＝荷葉堿含量／荷葉堿含量最大值，D＝干膏率／干膏率最大值）。結果見表2。

2.2 抗炎鎮(zhèn)痛作用 本研究以小鼠耳廓腫脹、熱板法、扭體法和大鼠足跖腫脹實驗作為藥效學評價指標，對4 種提取物抗炎鎮(zhèn)痛作用進行考察［9］。

通過Graphpad prism 5.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示，2 組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.2.1 二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗 參考文獻［10］報道，取雄性昆明種小鼠140 只，體質量（20±2）g，隨機分為14 組，每組10 只，分別為醇提法、水提法、醇水雙提法、揮發(fā)油雙提法高、中、低劑量組（18.20、9.10、4.55 g／kg），地塞米松組（10 mg／kg），生理鹽水組，連續(xù)灌胃給藥7 d。末次給藥0.5 h 后，用微量加樣器于其右耳內外兩側均勻涂布二甲苯25 μL／側，左耳不處理作為對照。2 h后脫頸椎處死，沿耳廓基部剪下雙耳，用6.0 mm 打耳器在相同位置打下兩圓耳片，各自稱定質量，以兩耳片質量之差為腫脹程度，并計算腫脹抑制率。結果表明，與生理鹽水組比較，地塞米松組，醇提法低、中、高劑量組，水提法高劑量組，醇水雙提法中、高劑量組，揮發(fā)油雙提低、中、高劑量組小鼠耳廓腫脹度降低（P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量依賴性，其中以醇提法高劑量組抗炎活性最強，見表3。

表3 清咽潤喉復方對小鼠耳廓腫脹程度的影響（±s， n ＝10）

表3 清咽潤喉復方對小鼠耳廓腫脹程度的影響（±s， n ＝10）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2.2 角叉菜膠致大鼠足跖腫脹實驗 參考文獻［10］報道，取SD 大鼠140 只，雌雄各半，隨機分為14 組，每組10 只，分別為分別為醇提法、水提法、醇水雙提法、揮發(fā)油雙提法高、中、低劑量組（18.20、9.10、4.55 g／kg），地塞米松組（10 mg／kg），生理鹽水組，連續(xù)灌胃給藥7 d。末次給藥1 h 后，用足趾容積測量儀測其正常右后足跖容積，并于大鼠右后足跖皮下注入新鮮角叉菜膠0.1 mL／爪，分別于致炎后1、2、3、4、5、6 h 測定其右后足跖容積，計算腫脹值。結果表明，與生理鹽水組比較，地塞米松組，醇提法低、中、高劑量組，水提法高劑量組，醇水雙提法中、高劑量組，揮發(fā)油雙提低、中、高劑量組大鼠足關節(jié)腫脹值降低（P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量依賴性，其中醇提法、揮發(fā)油雙提法高劑量組抗炎活性最強，見表4。

表4 清咽潤喉復方對大鼠足趾腫脹值的影響（±s， n＝10）

表4 清咽潤喉復方對大鼠足趾腫脹值的影響（±s， n＝10）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2.3 小鼠熱板法鎮(zhèn)痛實驗 參考文獻［11］報道，取雌性昆明種小鼠140 只，體質量（20±2）g，隨機分為14 組，每組10 只，分別為醇提法、水提法、醇水雙提法、揮發(fā)油雙提法高、中、低劑量組（18.20、9.10、4.55 g／kg），阿司匹林組（200 mg／kg），生理鹽水組，連續(xù)灌胃給藥7 d。于末次給藥后，以熱板法（55±0.5）℃分別在30、60、120 min測量小鼠痛閾值。結果表明，與生理鹽水組比較，阿司匹林組，醇提法低、中、高劑量組，水提法高劑量組，醇水雙提法中、高劑量組，揮發(fā)油雙提低、中、高劑量組小鼠痛閾值升高（P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量依賴性，其中醇提法、揮發(fā)油雙提法高劑量組活性最強，見表5。

表5 清咽潤喉復方對小鼠熱板性疼痛的影響（±s， n＝10）

表5 清咽潤喉復方對小鼠熱板性疼痛的影響（±s， n＝10）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2.4 小鼠扭體法鎮(zhèn)痛實驗 參考文獻［12］報道，取雄性昆明種小鼠140 只，體質量（20±2）g，隨機分為14 組，每組10 只，分別為醇提法、水提法、醇水雙提法、揮發(fā)油雙提法高、中、低劑量組（18.20、9.10、4.55 g／kg），阿司匹林組（200 mg／kg），生理鹽水組，連續(xù)灌胃給藥7 d。末次藥1 h 后，各組小鼠腹腔注射0.6% 冰醋酸0.1 mL／10 g。以小鼠腹部內凹，后肢伸直，臀部抬起，蠕行為指標，觀察記錄注射0.6%冰醋酸后15 min 內小鼠的扭體次數(shù)，并計算抑制率。結果表明，與生理鹽水組比較，阿司匹林組，醇提法低、中、高劑量組，水提法高劑量組，醇水雙提法中、高劑量組，揮發(fā)油雙提低、中、高劑量組小鼠平均扭體次數(shù)減少（P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量依賴性，其中醇提法、揮發(fā)油雙提法高劑量活性最強，見表6。

表6 清咽潤喉復方對小鼠扭體反應的影響（±s， n＝10）

表6 清咽潤喉復方對小鼠扭體反應的影響（±s， n＝10）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3 討論

青果多酚具有較好的抗炎活性，青果多酚中沒食子酸含量較多，故可選用沒食子酸為清咽潤喉復方的指標性成分［13］。研究發(fā)現(xiàn)，青果濱蒿內酯具有消炎止痛作用，故認為沒食子酸、濱蒿內酯兩者協(xié)同增效，從而發(fā)揮青果清熱利咽的作用［14］。研究表明，荷葉主要活性成分生物堿抗炎作用最強［15-18］。綜合以上因素考慮，本研究選擇沒食子酸、濱蒿內酯、荷葉堿為清咽潤喉復方有效成分考察指標。可能由于沒食子酸在水中的溶解度大，濱蒿內酯、荷葉堿在乙醇中的溶解度大，故本研究中雙提法能將大量水溶性和醇溶性成分提出，增加出膏率，綜合評分較高（99.39分）。

復方有效性是多成分綜合作用的結果，本研究以小鼠耳廓腫脹、熱板法、扭體法、大鼠足跖腫脹實驗作為藥效學評價指標，對復方提取方法進行優(yōu)化［9］。結果表明，醇提法和揮發(fā)油雙提法中、高劑量，醇水雙提法高劑量組均對小鼠耳廓腫脹度有抑制作用（P＜0.01）；醇提法和揮發(fā)油雙提法中、高劑量組均能減少小鼠平均扭體次數(shù)（P＜0.01）；醇提法和揮發(fā)油雙提法中、高劑量組均能緩解大鼠足關節(jié)腫脹程度和提高小鼠的痛閾值（P＜0.01），其中醇提法和揮發(fā)油雙提法所得提取液的抗炎鎮(zhèn)痛作用最強。

綜上所述，本研究通過對比清咽潤喉復方不同提取方法有效成分含量和抗炎鎮(zhèn)痛效果，證明揮發(fā)油雙提法為該復方最佳提取方法，為進一步的提取工藝和相關新型產(chǎn)品研究開發(fā)提供理論與實驗基礎。