獨一味配方顆粒藥效學研究

張 愷黃鈺婷宇文歡莎廖嘉寶*樊官偉*

（1.天津中醫藥大學第一附屬醫院，國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300193； 2.華潤三九醫藥股份有限公司，廣東 深圳 518110； 3.天津市中醫方證轉化研究重點實驗室，天津 300193； 4.天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 301617）

獨一味Lamiophlomis rotata（Benth.）Kudo 為我國藏族民間傳統藥材，應用歷史悠久，具有活血止血、祛風止痛功效，臨床上用于治療跌打損傷、外傷出血、風濕痹痛等［1-2］。目前獨一味單味制劑共有兩種劑型收錄于2020 年版《中國藥典》，分別為膠囊劑與片劑。運用現代制藥工藝技術將獨一味藥材進一步提取加工制成配方顆粒，是獨一味制劑現代化劑型改革的一次有益嘗試。配方顆粒相較于傳統劑型具有調配靈活、隨證加減、劑量準確、服用方便等優勢，但其療效確切與否目前仍有部分爭議，一定程度上制約了其臨床應用與市場推廣［3-4］。因此，中藥配方顆粒的有效性評價是當前研究的重點。針對獨一味配方顆粒的藥效學評價，目前尚缺乏相關研究報道。本研究以獨一味配方顆粒為研究對象，分別以醋酸誘導的小鼠扭體疼痛模型、福爾馬林致痛小鼠模型以及佐劑性關節炎大鼠模型，對獨一味配方顆粒的鎮痛、抗炎、止血藥效進行綜合評價，以期為其臨床應用提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器 YLS-7C 足趾容積測量儀（濟南益延科技發展有限公司）；NX-102 動物即時凝血分析儀（廣州萬孚生物技術股份有限公司）；Varioskan Lux 多功能微孔板讀數儀、Legend Micro 21R 冷凍高速離心機、MaxQ 4450 小型臺式恒溫搖床（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；GENIUS 3 渦旋混合器（德國IKA 公司）；NewClassic MF 電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Milli-Q Integral 5 超純水系統（美國Millipore 公司）。

1.2 動物 SPF 級雄性ICR 小鼠，體質量18～22 g；SPF級雄性SD 大鼠，體質量180～200 g，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2016-0006。實驗動物飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心，實驗動物使用許可證號SYXK（津）2019-0002。實驗動物操作均遵從中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物倫理委員會審定的規范要求。

1.3 藥物與試劑 獨一味配方顆粒由華潤三九醫藥股份有限公司提供（批號2004001Y），每1 g 獨一味配方顆粒相當于4 g 飲片；獨一味膠囊購自康縣獨一味生物制藥有限公司（批號1911026305）。布洛芬片（0.1 g／片）購自特一藥業集團股份有限公司（批號32191204）；云南白藥（4.0 g／瓶）購自云南白藥集團股份有限公司（批號ZHA1914）。實驗時取布洛芬片研磨成細粉（或取云南白藥細粉），加入蒸餾水與0.5%羧甲基纖維素鈉，配制成所需濃度的混懸液。冰醋酸（天津市風船化學試劑科技有限公司，批號202005262）；福爾馬林溶液（北京索萊寶科技有限公司，批號20191213）；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑（美國Sigma-Aldrich 公司，批號SLCF1289、SLBW2506）。大鼠白細胞介素1β（IL-1β）（批號KE20005）、大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 檢測試劑盒（批號KE20001）購自美國Proteintech Group 公司；大鼠白細胞介素6（IL-6）ELISA 檢測試劑盒（批號011020200529）購自上海碧云天生物技術研究所；大鼠α 顆粒膜糖蛋白（GMP-140）（批號CSB-E07399r）、大鼠凝血酶-抗凝血酶復合物（TAT）ELISA 檢測試劑盒（批號CSB-E08432r）購自武漢華美生物工程有限公司。

2 方法

2.1 分組與造模

2.1.1 醋酸致小鼠扭體模型 將48 只ICR 小鼠隨機分為空白組，模型組，獨一味配方顆粒低、高劑量組，獨一味膠囊組，陽性藥組，每組8 只。配方顆粒低、高劑量組小鼠分別灌胃給予0.059、0.29 g／kg 獨一味配方顆粒水溶液；膠囊組灌胃給予0.35 g／kg 膠囊內容物水溶液；陽性藥組灌胃給予0.078 g／kg 布洛芬混懸液；空白組與模型組灌胃給予等量蒸餾水，每天1 次，連續給藥5 d。于給藥第5 天，末次給藥1 h后，模型組與各給藥組小鼠腹腔注射0.6%醋酸0.02 mL／g，誘發小鼠扭體反應，空白組注射等量生理鹽水。記錄各組小鼠初次發生扭體反應（腹部收縮內凹，軀干與后肢伸展，臀部與一側肢體內旋）的時間，以及20 min 內小鼠發生扭體反應的次數。

2.1.2 福爾馬林致痛小鼠模型 小鼠按“2.1.1” 項下分組、給藥。于給藥第5 天，末次給藥1 h 后，模型組與各給藥組小鼠左后足跖皮下注射5%福爾馬林50 μL，誘發小鼠舔足反應，生理鹽水組注射等量生理鹽水。皮下注射后，立即將小鼠放入燒杯內并計時，分別記錄第Ⅰ時相神經疼痛期（0～5 min）和第Ⅱ時相炎性疼痛期（15～30 min）小鼠舔（抓咬）左后足的累計時間，計算小鼠舔足反應的抑制率。

2.1.3 佐劑性關節炎大鼠模型 將48 只SD 大鼠隨機分為空白組，模型組，獨一味配方顆粒低、高劑量組，獨一味膠囊組，陽性藥組，每組8 只。造模第1 天，于大鼠左后足跖與尾根部皮內注射弗氏完全佐劑0.1 mL，并于造模第11 天在相同部位皮內注射不完全弗氏佐劑0.1 mL 加強免疫。于造模第18 天開始灌胃給藥，配方顆粒低、高劑量組大鼠分別灌胃給予0.041、0.20 g／kg 獨一味配方顆粒水溶液；膠囊組灌胃給予0.24 g／kg 膠囊內容物水溶液；陽性藥組灌胃給予0.054 g／kg 布洛芬混懸液；空白組與模型組灌胃給予等量蒸餾水，每天1 次，連續給藥7 d。

2.2 足跖腫脹度檢測 分別于造模前、造模第17 天及給藥第7 天，采用足跖容積測量儀測量大鼠左后足跖及無毛區以下的足跖容積，計算給藥后大鼠足跖腫脹率。

2.3 炎癥因子檢測 于給藥第7 天，足跖腫脹度檢測結束2 h 后，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（3 mL／kg）麻醉，腹主動脈采血，室溫放置2 h 后3 500 r／min 低溫離心10 min，分離上層血清，采用ELISA 法檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。

2.4 斷尾出血時間檢測 大鼠于末次灌胃給藥1 h 后，固定于固定器，尾部清洗消毒后，距尾尖部10 mm 處橫斷，每隔30 s 用濾紙片吸去血滴1 次，直至出血自然停止，記錄自斷尾起至用濾紙吸至無血時的時間。

2.5 血液凝集參數檢測 出血時間測定1.5 h 后，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（3 mL／kg）麻醉，腹主動脈采血，加入枸櫞酸鈉抗凝管，采用凝血分析儀測定大鼠血漿的凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）和纖維蛋白原（FIB）。

2.6 血小板活化標志物檢測 取枸櫞酸抗凝全血，3 500 r／min 低溫離心10 min，分離上層血漿，ELISA 法檢測血漿GMP-140、TAT 水平。

2.7 統計學分析 通過SPSS 19.0 軟件進行處理，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，統計前對樣本數據進行正態分布與方差齊性檢驗，偏態分布數據采用Mann-Whitney U 檢驗分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 扭體反應觀察 與模型組比較，獨一味配方顆粒高劑量組、膠囊組與陽性藥組小鼠扭體次數均減少（P＜0.05，P＜0.01），陽性藥組小鼠初次扭體時間延長（P＜0.05），見表1。

表1 獨一味對醋酸致小鼠扭體反應的影響（±s， n＝8）

表1 獨一味對醋酸致小鼠扭體反應的影響（±s， n＝8）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 舔足反應觀察 由表2 可知，與空白組比較，模型組小鼠在第Ⅰ、Ⅱ時相中的舔足反應累計時間均延長（P＜0.01），表明動物模型成功建立；與模型組比較，獨一味配方顆粒高劑量組、膠囊組、陽性藥組小鼠Ⅱ相舔足反應累計時間均減少（P＜0.05）。高劑量獨一味配方顆粒與獨一味膠囊對福爾馬林誘導的小鼠Ⅱ相舔足反應抑制率分別為30.91%、32.17%，高于Ⅰ相抑制率，提示對福爾馬林誘導的Ⅱ相炎性疼痛具有抑制作用，但對Ⅰ相神經疼痛的干預作用有限。

表2 獨一味對福爾馬林誘導的小鼠疼痛模型的影響（±s， n＝8）

表2 獨一味對福爾馬林誘導的小鼠疼痛模型的影響（±s， n＝8）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 佐劑性關節炎大鼠足跖腫脹度 造模后各組大鼠足跖與踝關節腫脹明顯，呈進行性加重。與空白組比較，各組大鼠足跖容積均增大（P＜0.01）；與模型組比較，獨一味配方顆粒高劑量組、膠囊組與陽性藥組大鼠足跖容積均縮小（P＜0.05），大鼠足跖腫脹率降低（P＜0.05），提示獨一味配方顆粒可減輕佐劑性關節炎大鼠的足跖腫脹度，改善關節炎癥狀，見表3。

表3 獨一味對佐劑性關節炎大鼠足跖腫脹的影響（±s， n＝8）

表3 獨一味對佐劑性關節炎大鼠足跖腫脹的影響（±s， n＝8）

注：與造模第17 天空白組比較，＃＃P＜0.01；與給藥第7 天空白組比較，??P＜0.01；與給藥第7 天模型組比較，*P＜0.05。

3.4 佐劑性關節炎大鼠炎癥因子 由圖1 可知，與空白組比較，佐劑性關節炎大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），獨一味配方顆粒高劑量組與膠囊組大鼠血清IL-6、TNF-α 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 獨一味對佐劑性關節炎大鼠血清IL-1β（A）、IL-6（B）、TNF-α（C）水平的影響（±s， n＝8）

3.5 大鼠斷尾出血時間 由表4 可知，高、低劑量獨一味配方顆粒均能縮短正常大鼠的斷尾出血時間（P＜0.05），提示獨一味配方顆粒可發揮一定的止血功效。

表4 獨一味對大鼠出血時間的影響（±s， n＝8）

表4 獨一味對大鼠出血時間的影響（±s， n＝8）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.6 血液凝集參數 凝血四項檢測結果見表5，獨一味配方顆粒、獨一味膠囊、云南白藥對大鼠PT、TT、APTT 均無顯著影響（P＞0.05）。與空白組比較，各給藥組大鼠FIB值均增加（P＜0.05，P＜0.01）。

表5 獨一味對大鼠血液凝集參數的影響（±s， n＝8）

表5 獨一味對大鼠血液凝集參數的影響（±s， n＝8）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.7 血小板活化標志物測定 由圖2 可知，與空白組比較，獨一味配方顆粒高劑量組、膠囊組、云南白藥組大鼠血漿GMP-140 與TAT 水平均上調（P＜0.05，P＜0.01），提示促進血小板活化可能是獨一味配方顆粒發揮止血作用的機制。

圖2 獨一味對大鼠血漿GMP-140（A）、TAT（B）水平的影響（±s， n＝8）

4 討論

本研究選用2 種經典的疼痛動物模型探討獨一味配方顆粒的鎮痛作用。其中，醋酸誘導的小鼠扭體疼痛模型以低濃度的醋酸作為化學性致炎因子，通過腹腔注射使小鼠產生劇烈疼痛而出現扭體反應，是一種非選擇性外周疼痛模型［5］。結果顯示獨一味配方顆粒可減少醋酸誘導的小鼠扭體反應次數，表明獨一味配方顆粒對急性疼痛可發揮一定的鎮痛效應。另一方面，福爾馬林致痛模型表現出明顯的兩相疼痛反應，Ⅰ相（0～5 min）反應為刺激中樞神經末梢所致，由福爾馬林的化學刺激以及注射器的物理刺激引起；Ⅱ相（15～30 min）反應則由內源性炎癥因子引起，為相關炎癥介質增多所致［6］。模型組小鼠經福爾馬林皮下注射誘導出現頻繁且持續的舔足反應［7］。獨一味配方顆粒抑制模型小鼠的Ⅱ相疼痛反應，縮短舔足反應累計時間，增加舔足反應抑制率，證明獨一味配方顆粒具有鎮痛作用，尤其對炎性介質參與的疼痛表現出較好的鎮痛藥效。

為了進一步探討獨一味配方顆粒的抗炎藥效，建立佐劑誘導的關節炎大鼠模型，結果表明高劑量獨一味配方顆粒可減輕關節炎大鼠的足跖腫脹度，降低大鼠足跖腫脹率，緩解關節炎癥狀。IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎性細胞因子是滑膜炎癥及關節損傷的重要介質［8-9］，在類風濕關節炎的發生發展中發揮關鍵作用［10］。佐劑性關節炎大鼠模型血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均升高；獨一味配方顆粒給藥后，大鼠血清IL-6、TNF-α 水平均下調，提示獨一味配方顆粒可抑制血清炎性因子表達，發揮一定的抗炎藥效。環烯醚萜苷類化合物為獨一味的主要抗炎活性成分［11］，其可通過抑制環氧合酶活性，減少前列腺素的合成而發揮抗炎活性［12］。其中，8-乙酰氧基山梔苷甲酯與8-去羥基山梔子苷為代表性化學成分，具有較強的抗炎作用［5］。8-乙酰氧基山梔苷甲酯可通過抑制TNF-α 介導的NF-κB 活化，減少炎癥相關細胞因子的合成釋放而發揮抗炎作用［13］，這可能是獨一味制劑發揮抗炎作用的重要分子機制。

在止血藥效方面，獨一味配方顆粒可縮短正常大鼠的斷尾出血時間。PT 主要反映外源性凝血系統功能；APTT可反映內源性凝血系統功能；TT 反映凝血共同途徑狀態；FIB 則為凝血酶作用的底物［14］。獨一味配方顆粒可升高大鼠血液FIB 水平，但對PT、TT、APTT 無顯著影響，提示獨一味配方顆粒可能通過增加纖維蛋白原水平，影響凝血-纖溶系統而發揮止血功效。另外，獨一味配方顆粒可上調大鼠血漿GMP-140 與TAT 水平。GMP-140 存在于血小板α顆粒內，是反映血小板活化程度的特異性指標［15］。TAT 則是體內凝血和抗凝血相互作用的產物，是凝血酶生成的標志物之一［16］。以上結果提示獨一味配方顆粒的止血機制可能與升高大鼠血液FIB 水平，上調血漿GMP-140 與TAT 水平相關。

綜上所述，獨一味配方顆粒可抑制醋酸與福爾馬林誘導的小鼠疼痛反應，減輕佐劑性關節炎大鼠的足跖腫脹度，下調大鼠血清IL-6 與TNF-α 水平，并可縮短正常大鼠的斷尾出血時間，調節大鼠血液FIB 與血漿GMP-140、TAT 水平，其中高劑量配方顆粒的鎮痛、抗炎、止血藥效與獨一味膠囊等效。該研究為獨一味配方顆粒的臨床應用提供了一定的藥效學依據。