基于PCSK9-LDLR 信號(hào)通路探討三七破壁粉對(duì)高脂血癥大鼠的降脂作用

翁路安，蘇 潔，王 婷，陳素紅，高鴻斐，呂圭源*

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053； 2.浙江工業(yè)大學(xué)，浙江 杭州 310014； 3.浙江英特醫(yī)藥藥材有限公司，浙江 杭州 310000）

高脂血癥是臨床上常見的脂質(zhì)代謝紊亂性疾病，根據(jù)臨床表現(xiàn)，中醫(yī)常將其歸于“痰瘀” 范疇，《醫(yī)學(xué)心悟》提到：“凡人嗜食肥甘，或醇酒奶酪，則濕從內(nèi)受”。可見過食肥甘厚味醇酒之品，會(huì)令濕熱內(nèi)生，損傷脾胃運(yùn)化，清者不升，濁者不降，導(dǎo)致“痰濁” 等病理產(chǎn)物瘀留于內(nèi)。前期研究表明，高脂飲食加酒精喂養(yǎng)，能造成大鼠脂質(zhì)代謝紊亂，同時(shí)引起血液黏度的升高［1］。

《血證論》 提到：“須知痰水之壅，由瘀血使然，但去瘀血，則痰水自行”，可見活血化瘀法對(duì)于痰濁有治療作用。三七具有活血化瘀、補(bǔ)血、止血等作用，臨床上常用于治療高脂血癥等心血管疾?。?-3］。研究報(bào)道三七具有改善脂質(zhì)代謝及血液流變學(xué)等作用［4-5］。三七破壁粉是將三七經(jīng)超微粉碎技術(shù)加工為粒徑小于75 μm 的粉體制劑，傳統(tǒng)飲片經(jīng)過超微粉碎后，其藥物表面積增大，有效成分的溶出也隨之增加，從而提高了生物利用度。有研究發(fā)現(xiàn)三七經(jīng)超微粉碎后其3 種皂苷類成分的溶出速率均明顯提高［6］，其活血化瘀等藥理作用也隨之增強(qiáng)［7］，推測(cè)三七破壁粉改善血脂水平的作用可能也隨之增強(qiáng)。目前，關(guān)于三七調(diào)節(jié)血脂的作用研究主要集中在其有效成分或不同的提取部位，尚未見三七破壁粉調(diào)節(jié)血脂作用的研究報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)通過高脂復(fù)合飲酒建立高脂血癥大鼠模型，檢測(cè)血脂、血流變、肝臟病變等指標(biāo)，以及肝組織中PCSK9、LDLR 的mRNA 和蛋白表達(dá)，研究三七破壁粉對(duì)高脂血癥的藥效作用及相關(guān)降脂機(jī)制，以期為中藥超微粉入藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量300～400 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，光照12 h 更替，循環(huán)通風(fēng)換氣。

1.2 試劑與藥物 三七破壁粉（文山市苗鄉(xiāng)三七實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)BSQ-SQ-180110）。高脂高膽固醇飼料（南通特洛菲飼料科技有限公司，批號(hào)20190829）；紅星二鍋頭酒（北京紅星股份有限公司，批號(hào)20190604）；總膽固醇（TC，批號(hào)190115101）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c，批號(hào)190508201）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c，批號(hào)190510211）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST，批號(hào)190612101）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT，批號(hào)190619101），均購自寧波美康生物科技有限公司；纖維蛋白原（Fb）試劑盒（貨號(hào)MM-61544R1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒（貨號(hào)MM-0180R1）、大鼠白介素6（IL-6）試劑盒（貨號(hào)MM-0190R1），均購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；低密度脂蛋白受體（LDLR）抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司，貨號(hào)A14996）；前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶／kexin9 型（PCSK9）抗體（貨號(hào)WL03068）、羊抗兔IgGHRP（貨號(hào) WLA023）、內(nèi)參抗體 β-actin（貨號(hào)WL01845），均購自沈陽萬類生物科技有限公司；TRIpure（貨號(hào)RP1001）、Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶（貨號(hào)PR6502）、RNase inhibitor（貨 號(hào) RP5602）、2 × Power Taq PCR MasterMix（貨號(hào)PR1702），均購自美國BioTek 公司；SYBR Green（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)SY1020）；引物由金斯瑞生物科技股份有限公司合成。

1.3 儀器 FA2204B 型電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）；FASCO-3010D 型全自動(dòng)血流變快測(cè)儀（重慶維多科技有限公司）；D-37520 型微量離心機(jī)、NANO 2000型紫外分光光度計(jì)（美國Thermo 公司）；TBA-40FR 型全自動(dòng)生化分析儀（日本東芝醫(yī)療系統(tǒng)株式會(huì)社）；Powerwave340 型酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；DYCZ-24DN型雙垂直蛋白電泳儀、WD-9413B 型凝膠成像系統(tǒng)（北京六一生物科技有限公司）；Exicycler 96 型熒光定量PCR 儀（韓國Bioneer 公司）。

2 方法

2.1 模型建立與分組給藥 大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組和三七破壁粉低、中、高劑量（12.5、25、50 mg／kg）組，每組8 只。除正常組給予普通飼料和飲水喂養(yǎng)，其余各組采用高脂復(fù)合飲酒喂養(yǎng)。造模4 周后，各給藥組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，正常組和模型組灌胃給予蒸餾水，灌胃容量為10 mL／kg，每天1 次，連續(xù)16 周。

2.2 血脂及肝功能指標(biāo)檢測(cè) 給藥8、14 周，大鼠禁食不禁水12 h，眼眶取血，37 ℃水浴靜置1 h，3 500 r／min 離心10 min，取上層血清，采用全自動(dòng)血生化儀檢測(cè)血清中TC、HDL-c、LDL-c、AST、ALT 水平。

2.3 血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 給藥15 周，禁食不禁水12 h，眼眶取血置于肝素鈉抗凝管中，采用全自動(dòng)血流變快測(cè)儀檢測(cè)全血黏度和血漿黏度。待測(cè)完全血黏度后，3 500 r／min 離心10 min，分離上層血漿，按試劑盒說明書檢測(cè)血漿中Fb 水平。

2.4 血清IL-6、TNF-α 水平檢測(cè) 給藥15 周，禁食不禁水12 h，眼眶取血，37 ℃水浴靜置1 h，3 500 r／min 離心10 min，取上層血清，按試劑盒說明書檢測(cè)大鼠血清IL-6、TNF-α 水平。

2.5 肝臟系數(shù)及肝組織病理變化 末次給藥后，大鼠禁食不禁水12 h，稱定體質(zhì)量，解剖取肝臟，生理鹽水清洗干凈，稱量臟器濕重，計(jì)算肝臟系數(shù)。取肝臟相同部位，經(jīng)10%福爾馬林固定48 h，乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，制備4 μm 石蠟切片，分別進(jìn)行HE 和Masson 染色，中性樹脂封片干燥后，生物顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變和膠原沉積情況。

2.6 RT-qPCR 法檢測(cè)肝組織LDLR、PCSK9 mRNA 表達(dá)參照TRIpure 試劑盒說明書提取大鼠肝組織總RNA，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量樣本RNA 濃度，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增（94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)）。以β-actin為內(nèi)參，用2－ΔΔCT法計(jì)算LDLR、PCSK9 mRNA 相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 Western blot 法檢測(cè)肝組織LDLR、PCSK9 蛋白表達(dá)取各組肝組織樣本，解凍后加入RIPA 裂解液，冰上勻漿裂解30 min，4 ℃、12 000 r／min 離心10 min，收集上清液（總蛋白溶液），BCA 法測(cè)蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，TBST 漂洗，5% 脫脂奶粉封閉1 h，加一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌3 次，加二抗室溫孵育1 h，TBST 洗滌3 次，滴加ECL 工作液1～2 min 后去盡殘液，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析數(shù)據(jù)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 三七破壁粉對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平的影響 給藥8周時(shí)，與正常組比較，模型組大鼠血清TC、LDL-c 水平升高（P＜0.01），HDL-c 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，三七破壁粉各劑量組大鼠血清TC、LDL-c 水平均降低（P＜0.01），見表2。給藥14 周時(shí)，與正常組比較，模型組大鼠血清TC、LDL-c 水平均升高（P＜0.01），HDL-c 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，三七破壁粉各劑量組大鼠血清TC、LDL-c 水平均降低（P＜0.01），三七破壁粉高劑量組血清HDL-c 水平升高（P＜0.01），見表3。結(jié)果表明，三七破壁粉可以有效調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠血清TC、LDL-c 水平。

表2 三七破壁粉給藥8 周對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平的影響（mmol／L，±s， n＝8）

表2 三七破壁粉給藥8 周對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平的影響（mmol／L，±s， n＝8）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

表3 三七破壁粉給藥14 周對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平的影響（mmol／L，±s， n＝8）

表3 三七破壁粉給藥14 周對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平的影響（mmol／L，±s， n＝8）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.2 三七破壁粉對(duì)高脂血癥大鼠血清肝功能的影響 給藥8 周時(shí)，與正常組比較，模型組大鼠血清ALT、AST 水平均升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，三七破壁粉各劑量組血清ALT 水平降低（P＜0.01），AST 水平有所降低但無顯著差異（P＞0.05）。給藥14 周時(shí)，與正常組比較，模型組大鼠血清ALT、AST 水平均升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，三七破壁粉各劑量組大鼠血清ALT水平降低（P＜0.01），高劑量組血清AST 水平（P＜0.05），見表4。結(jié)果表明，三七破壁粉可以改善高脂血癥大鼠血清肝功能水平，尤其對(duì)ALT 水平的改善效果較顯著。

表4 三七破壁粉對(duì)高脂血癥大鼠血清ALT、AST 水平的影響（U／L，±s， n＝8）

表4 三七破壁粉對(duì)高脂血癥大鼠血清ALT、AST 水平的影響（U／L，±s， n＝8）

注：與正常組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 三七破壁粉對(duì)高脂血癥大鼠血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)的影響 與正常組比較，模型組大鼠全血黏度無顯著差異（P＞0.05），血漿黏度升高（P＜0.05）；與模型組比較，三七破壁粉各劑量組大鼠全血黏度和血漿黏度均降低（P＜0.05，P＜0.01），見表5。結(jié)果表明，三七破壁粉可以改善高脂血癥大鼠的血液黏度。

表5 三七破壁粉對(duì)高脂血癥大鼠血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)的影響（±s， n＝7～8）

表5 三七破壁粉對(duì)高脂血癥大鼠血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)的影響（±s， n＝7～8）

注：與正常組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 三七破壁粉對(duì)高脂血癥大鼠血漿Fb 及血清IL-6、TNF-α 水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠IL-6、TNF-α、Fb 水平均升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，三七破壁粉低劑量組TNF-α、IL-6、Fb 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），高劑量組TNF-α 水平降低（P＜0.01），見表6。結(jié)果表明，三七破壁粉可以改善高脂血癥大鼠血清炎癥因子及血漿纖維蛋白原水平。

表6 三七破壁粉對(duì)高脂血癥大鼠血漿Fb 及血清IL-6、TNF-α 水平的影響（±s， n＝8）

表6 三七破壁粉對(duì)高脂血癥大鼠血漿Fb 及血清IL-6、TNF-α 水平的影響（±s， n＝8）

注：與正常組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.5 三七破壁粉對(duì)高脂血癥大鼠肝臟病變的影響 與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量和肝臟質(zhì)量升高（P＜0.01）；給藥16 周后，與模型組比較，三七破壁粉各劑量組大鼠體質(zhì)量和肝臟質(zhì)量降低（P＜0.01），中、高劑量組肝臟指數(shù)降低（P＜0.05，P＜0.01），見表7。結(jié)果表明，三七破壁粉可以改善高脂血癥大鼠的肝臟指數(shù)。

表7 三七破壁粉對(duì)高脂血癥大鼠肝臟病變的影響（±s， n＝7～8）

表7 三七破壁粉對(duì)高脂血癥大鼠肝臟病變的影響（±s， n＝7～8）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

HE 染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肝細(xì)胞胞質(zhì)豐富、大小均勻，肝索排列整齊，肝竇清晰可見，肝細(xì)胞脂肪變性和炎癥浸潤少見，肝細(xì)胞在靜脈周圍呈放射狀整齊排列；模型組大鼠肝索排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞間隙增大，出現(xiàn)大小不一的脂肪空泡；與模型組比較，三七破壁粉各劑量組大鼠肝細(xì)胞脂肪病變均有不同程度減輕，見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織HE 染色圖（×200）

Masson 染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肝臟血管及周圍有輕度的膠原沉積被染成藍(lán)色；模型組大鼠肝臟中有較多的膠原沉積，在血管周圍及細(xì)胞間質(zhì)可明顯觀察到纖維增加；與模型組比較，三七破壁粉各劑量組肝細(xì)胞之間膠原纖維相對(duì)減少，見圖2。

圖2 各組大鼠肝組織Masson 染色圖（×100）

3.6 三七破壁粉對(duì)高脂血癥大鼠肝組織PCSK9、LDLRmRNA 表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠肝組織LDLRmRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），PCSK9 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，三七破壁粉各劑量組大鼠肝組織LDLRmRNA 表達(dá)升高（P＜0.01），PCSK9 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），見圖3。

圖3 三七破壁粉對(duì)高脂血癥大鼠肝組織PCSK9、 LDLR mRNA 表達(dá)的影響（±s， n＝3）

3.7 三七破壁粉對(duì)高脂血癥大鼠肝組織PCSK9、LDLR 蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠肝組織PCSK9蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），LDLR 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型組比較，三七破壁粉各劑量組大鼠肝組織PCSK9 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），LDLR 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），見圖4。

圖4 三七破壁粉對(duì)高脂血癥大鼠肝組織PCSK9、LDLR 蛋白表達(dá)的影響（±s， n＝3）

4 討論

《臨證指南》 指出“血病五臟、六腑皆有，三七治一切血癥”。三七為活血化瘀的代表藥，廣泛應(yīng)用于血液系統(tǒng)疾病等方面，可以降低高脂血癥患者血脂水平、血液黏度［8］，具有改善脂質(zhì)代謝及血液流變學(xué)等藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)，中藥經(jīng)超微粉碎后其有效成分在體內(nèi)的吸收速率也顯著提高［9-10］。三七總皂苷是三七的主要有效成分，具有調(diào)血脂、抗血栓和降低血小板活性等作用［11］。有研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷在消化道內(nèi)與脂類結(jié)合形成不易吸收的物質(zhì)，防止脂質(zhì)在血管內(nèi)沉積從而保護(hù)內(nèi)膜，防止動(dòng)脈粥樣硬化［12-13］。有效成分溶出的增加，有利于增強(qiáng)相應(yīng)的藥理作用，故本實(shí)驗(yàn)通過建立高脂血癥模型大鼠，研究三七破壁粉的降脂作用。

肝臟在血脂代謝中發(fā)揮重要的作用，同時(shí)也是血脂代謝紊亂直接受影響的臟器［14］。高脂復(fù)合飲酒造模后，大鼠肝臟指數(shù)升高，且肝臟呈肉眼可見的脂肪性病變。研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥能引起肝組織脂肪空泡和肝臟脂質(zhì)蓄積，同時(shí)肝小葉、細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度損傷［15］。病理結(jié)果顯示，模型組大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)彌漫性脂肪病變，表現(xiàn)為大量肝細(xì)胞的氣球樣病變和小泡脂滴，并伴有較多的灶性纖維化。肝臟損傷會(huì)影響肝功能水平并引起炎癥的發(fā)生，AST和ALT 主要分布在肝組織細(xì)胞中，其水平與肝細(xì)胞損傷程度呈正相關(guān)［16］，肝細(xì)胞損傷后血清中AST、ALT 水平升高。TNF-α 能在多方面影響脂質(zhì)代謝，抑制TNF-α 水平可減輕酒精引起的脂肪變性，酒精誘導(dǎo)的其他細(xì)胞因子（如IL-6等）也可能影響脂質(zhì)代謝水平［17］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖高脂復(fù)合飲酒喂養(yǎng)可使大鼠血清AST、ALT、TNF-α 和IL-6 水平升高，三七破壁粉可以降低大鼠血清AST、ALT、TNF-α和IL-6 水平，進(jìn)而減輕肝損傷程度，表明三七破壁粉可以改善高脂復(fù)合飲酒造成的肝損傷，對(duì)肝臟有保護(hù)作用。

研究發(fā)現(xiàn)PCSK9-LDLR 信號(hào)通路與血脂水平關(guān)系密切［18-19］，LDLR 在膽固醇代謝中發(fā)揮重要作用，其功能主要是通過內(nèi)吞LDL 等脂蛋白，將LDL-c 等攝取入細(xì)胞進(jìn)行代謝［20］。PCSK9 的主要生理功能之一是介導(dǎo)LDLR 的降解，控制LDL-c 顆粒在血液中循環(huán)的水平。當(dāng)PCSK9 與LDLR 的表皮生長因子A 結(jié)構(gòu)域結(jié)合時(shí)，可刺激LDLR 的降解。LDLR 表達(dá)的降低會(huì)導(dǎo)致LDL-c 代謝減弱，這可能會(huì)使TC 和LDL-c 水平升高［21-22］。本研究結(jié)果顯示，三七破壁粉可能通過降低PCSK9 蛋白和mRNA 的表達(dá)，減少對(duì)LDLR的降解；升高LDLR 表達(dá)，促進(jìn)肝臟對(duì)LDL-c 的攝取，使血脂維持在正常的水平。

綜上所述，三七破壁粉可以改善高脂復(fù)合飲酒誘發(fā)的高脂血癥大鼠血脂代謝異常，其機(jī)制可能是通過調(diào)控PCSK9-LDLR 信號(hào)通路減輕脂質(zhì)代謝紊亂。