大補脾湯對伊立替康所致小鼠遲發性腹瀉的影響

岳曉華張小平孫少伯王碧瑩謝曉蓉耿廣琴安方玉

（1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅中醫藥大學敦煌醫學與轉化教育部重點實驗室，甘肅蘭州 730000）

伊立替康廣泛用于治療結腸癌、胃癌、肺癌等，通過抑制DNA 拓撲異構酶I 發揮其抗腫瘤作用［1］，其常見副作用為腹痛、腹瀉、消瘦等，屬于中醫“泄瀉” 范疇［2］。伊立替康是腹瀉發生的重要外因，屬于中醫“毒邪”，使脾胃受損，運化失調，進而水濕內生，導致泄瀉的發生。目前伊立替康所導致的腹瀉的中醫證型認為有脾胃虛弱證、脾腎陽虛證、寒熱錯雜證、濕熱內蘊證、肝郁脾虛證等［3］，其中脾胃虛弱是其基本病機。敦煌古方大補脾湯主治脾氣大疲、飲食不化。因此，本研究探討大補脾湯對伊立替康導致的脾胃虛弱型腹瀉的影響。

1 材料

1.1 動物 50 只BALB／c 小鼠，6 周齡，體質量18～20 g，購于甘肅中醫藥大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK（甘）2015-0002。

1.2 試劑與藥物 大補脾湯（人參、炙甘草、干姜各15 g，白術、麥冬、五味子、旋覆花各5 g），購自北京同仁堂股份有限公司，經甘肅中醫藥大學高建德副教授鑒定合格。伊立替康（澳大利亞Pfizer Pty Limited 公司，批號H20160576）；TRIzol（美 國Ambion 公 司，批號15596-026）；逆轉錄酶、熒光定量PCR 參比染料（南京唯諾贊生物科技股份有限公司，批號R101-01／02、Q111-02）；核糖核酸酶抑制劑（北京全式金生物技術有限公司，批號J11202）；兔多抗GAPDH（杭州賢至生物有限公司，批號AB-P-R 001）；兔多抗MRP2（北京博奧森生物技術有限公司，批號bs-1092R）。

2 方法

2.1 藥物制備 藥材浸泡30 min，大火煮沸后用小火煎煮30 min，過濾，藥渣加水，同法再次煎煮30 min，過濾藥渣，合并藥液，濃縮至生藥量0.9 g／mL，－20 ℃下貯存。

2.2 分組及給藥 將50 只小鼠隨機分為空白組、模型組及大補脾湯低、中、高劑量組。除空白組外，其余各組小鼠腹腔注射伊立替康（36.8 mg／kg），每天1 次，連續4 d［4］。造模成功后，給予大補脾湯低、中、高劑量組4.29、8.58、17.16 g／kg 藥液，每天1 次，連續7 d。

2.3 取材 期間觀察各組小鼠的飲食、進水、精神和腹瀉等情況并記錄，同時計算小鼠稀便率、平均稀便級以及腹瀉指數。稀便級即稀便程度，用濾紙量稀便污染面積定級，每污染直徑＜1.0 cm 為1 級；污染直徑1.0～1.9 cm 為2級；污染直徑2.0～3.0 cm 為3 級；污染直徑＞3.0 cm 為4級。平均稀便級＝每只小鼠所有稀便級數相加的和／稀便次數。稀便率＝每只小鼠稀便數／總便數。以腹瀉指數作為評定小鼠腹瀉情況的主要指標［5-6］，腹瀉指數＝稀便率×平均稀便級。干預7 d 后摘眼球取血，注射器抽取結腸內容物測定β-葡萄糖醛酸苷酶活性，同時取小腸、肝臟組織樣本，收集混合糞便。

2.4 組織形態學觀察 取小腸組織，4% 多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，組織透明，石蠟浸蠟，包埋，切片（厚度4 μm），脫蠟，蘇木精-伊紅（HE）染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.5 小鼠糞便總DNA 的提取和PCR 擴增檢測 取小鼠混合軟濕糞便，總基因組DNA 用CTAB-SDS 法提取，稀釋DNA 為1 ng／μL，用帶有barcode 的特異引物擴增16S rRNA／18S rRNA／ITS 基因的V3＋V4 可變區（16S V4／16S V3／16S V3～V4／16S V4～V5，18S V4／18S V9，ITS1／ITS2，Arc V4 等）并測序。擴增體系為10 ng 模板DNA，正反向引物0.2 μmol／L，15 μL Phusion 超保真PCR Master Mix，總體積30 μL。PCR 擴增條件98 ℃預變性1 min，98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃溫度下5 min，共30 個循環。

2.6 RT-qPCR 檢測大腸桿菌相對數量 參照試劑盒說明書，提取基因組DNA，依據大腸桿菌的16S rRNA 序列設計引物（表1），將基因組DNA 稀釋到60 ng／μL，RTqPCR 法檢測小鼠大腸桿菌的相對數量，反應條件為50 ℃2 min，95 ℃10 min；95 ℃30 s，60 ℃30 s，40 個循環。通過2－ΔΔCT方法計算大腸桿菌的相對數量。

表1 引物序列

2.7 腸道β-葡萄糖醛酸苷酶的測定 取結腸內容物，稱定質量，加入9 倍量PBS，混勻，3 000 r／min 離心10 min，取上清，用比色法測定腸道β-葡萄糖醛酸苷酶活性。

2.8 Western blot 法檢測多藥耐藥相關蛋白2（MRP2）的表達 收集各組肝臟組織，加入裂解液處理30 min，離心，提取總蛋白，BAC 法測定蛋白濃度，95 ℃水浴變性，10%分離膠、5% 濃縮膠SDS-PAGE 蛋白電泳，轉膜，5% 脫脂奶粉-TBST 室溫封閉2 h，加入一抗（MRP2、GAPDH，1∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜5 次，加入二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST 洗膜5 次，ECL 試劑盒顯示免疫反應條帶，Bandscan 軟件分析膠片灰度值，GAPDH 作為內參，以目的條帶／GAPDH 條帶灰度值的比值表示目的條帶的相對表達量。

2.9 統計學分析 通過SPSS 18.0 軟件進行處理，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 一般情況 空白組小鼠飲食正常，反應敏捷，大便成形、質硬，無其他明顯異常改變；模型組小鼠出現蜷縮、倦臥、飲食減少、糞便稀溏、肛周黏膩等現象，體質量有所下降；大補脾湯干預后，上述癥狀均有所改善，主要表現為活動增加，體質量回升，腹瀉程度減輕。

3.2 腹瀉情況 與空白組比較，模型組小鼠稀便率、平均稀便級、腹瀉指數均升高（P＜0.01）；與模型組比較，大補脾湯各劑量組小鼠稀便率、平均稀便級和腹瀉指數均降低（P＜0.01），說明大補脾湯可有效減輕伊立替康所造成的腹瀉，見表2。

表2 各組腹瀉指數比較（±s， n＝10）

表2 各組腹瀉指數比較（±s， n＝10）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.3 小腸黏膜組織病理觀察 如圖1 所示，空白組小鼠小腸黏膜上皮完整，絨毛結構排列規則整齊，隱窩結構清晰；模型組小腸絨毛的形態和完整性被破壞，絨毛數量明顯減少，并可見大量絨毛變形、脫落、斷裂（黑色箭頭所示），以及伴隨隱窩結構的消失；而大補脾湯中、高劑量組小腸絨毛結構較完整，并可見明顯的隱窩結構。

圖1 小鼠小腸病理形態（×100）

3.4 腸道菌群豐度 伊立替康治療很容易導致腸道菌群的紊亂［7］，治療后腸道菌群的組成及豐度都有所變化［8］。如圖2 所示，伊立替康引起乳桿菌等益生菌的數量減少，假單胞菌、擬桿菌、丹毒絲菌等有害菌的升高；大補脾湯干預后，乳桿菌數量明顯回升，有害菌的增殖被抑制。

圖2 微生物種類分布情況

3.5 大腸桿菌數量變化 伊立替康毒性導致大腸桿菌的數量增加是引起腹瀉的原因之一［9］。與空白組比較，模型組大腸桿菌數量增加（P＜0.01）；與模型組比較，大補脾湯中、高劑量組大腸桿菌數量減少（P＜0.01），證明大補脾湯干預對伊立替康所導致的大腸桿菌升高有抑制作用，見表3。

表3 各組大腸桿菌數量比較（±s， n＝10）

表3 各組大腸桿菌數量比較（±s， n＝10）

注：與空白組比較，＃＃P ＜0.01；與模型組比較，* P ＜0.05，**P＜0.01。

3.6 β-葡萄糖醛酸苷酶活性變化 腸道共生菌群表達的細菌β-葡萄糖醛酸苷酶在藥物誘導的胃腸道上皮細胞毒性中起著重要作用［9-10］。如表4 所示，模型組β-葡萄糖醛酸苷酶活性升高（P＜0.01）；與模型組比較，大補脾湯各劑量組β-葡萄糖醛酸苷酶活性均有不同程度的降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 各組小鼠β-葡萄糖醛酸苷酶活性比較（±s， n＝10）

表4 各組小鼠β-葡萄糖醛酸苷酶活性比較（±s， n＝10）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.7 MRP2 蛋白表達 MRP2 介導伊立替康及其代謝產物的排泄［11］，如圖3、表5 所示，伊立替康導致肝臟MRP2表達升高（P＜0.05）；經大補脾湯干預后，MRP2 表達下降（P＜0.01）。

圖3 MRP2 蛋白條帶圖

表5 各組MRP2 蛋白表達比較（±s， n＝10）

表5 各組MRP2 蛋白表達比較（±s， n＝10）

注：與空白組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.01。

4 討論

伊立替康常見的臨床副作用是遲發性腹瀉，多表現為排便次數增加、糞便稀溏、甚至瀉出如水樣，或伴有嘔吐、腹痛脹氣、乏力等癥狀，屬于“泄瀉” “下利” 范疇。癌癥屬于消耗性疾病，由于病癥日久，患者本就素體虧虛，而化療藥物伊立替康作為一種毒性藥物，使患者脾胃更加虛弱，致使其運化功能失調，濕濁內生，發生泄瀉［2］，大補脾湯出自《輔行訣五臟用藥法要》，主治脾氣大疲，故本實驗探究大補脾湯對伊立替康致脾胃虛弱型腹瀉的干預作用。

目前普遍認為伊立替康所引起的胃腸道毒性與其獨特的肝腸循環有關［12］，伊立替康經肝臟代謝產物有7-乙基-10-羥基喜樹堿（SN-38）、葡萄糖醛酸化SN-38（SN-38G）和部分沒轉化的伊立替康，這些代謝產物通過膽汁排泄到腸道，SN-38G 在腸道菌群分泌的β-葡萄糖醛酸苷酶的作用下生成有毒性的SN-38。SN-38 可直接損傷腸黏膜，導致體內水分、電解質吸收障礙以及腸道炎癥的發生，引起嚴重腹瀉［10］。本實驗結果顯示，大補脾湯可以有效降低小鼠腹瀉指數和炎癥因子水平，明顯改善腸道黏膜損傷。前人認為健脾中藥通過抑制伊立替康引發的炎性反應而減輕對腸黏膜的損傷［13］，與本研究一致。

研究發現，伊立替康治療后會導致患者腸道菌群失調［9，12］，當腸道菌群紊亂時，會出現乏力、納呆、腹脹、腹瀉等癥狀，即出現中醫脾胃虛弱的癥狀［14］。因此，通過健脾類中藥來調節腸道菌群的平衡對減輕伊立替康所導致的脾胃虛弱具有重要意義。本研究發現，大補脾湯干預后腸道菌群的失調得以改善，假單胞菌、擬桿菌、丹毒絲菌等有害菌數量下降，乳桿菌等益生菌數量上升。

另外，研究發現，伊立替康治療后會導致致病菌特別是大腸桿菌大量增加，而β-葡萄糖醛酸苷酶的增多與大腸桿菌的增多有關［9］，細菌β-葡萄糖醛酸苷酶在伊立替康誘導的胃腸道上皮細胞毒性中發揮重要作用［10］。本研究結果表明，大補脾湯組大腸桿菌數量和β-葡萄糖醛酸苷酶活性均有所下降，可能是大補脾湯有效抑制了大腸桿菌的過度繁殖，降低了細菌β-葡萄糖醛酸苷酶活性而減輕了伊立替康的毒性。

MRP2 是伊立替康及其代謝產物在細胞外的轉運體，介導了SN-38G 從膽汁排泄至腸腔中的過程。SN-38G 在小腸中β-葡萄糖醛酸苷酶的作用下轉化為有毒性的SN-38，進而被重吸收、蓄積而引發腸黏膜細胞的損傷和腹瀉［11］，本研究結果顯示，大補脾湯干預后MRP2 蛋白表達下降，腹瀉程度得到改善，可能是大補脾湯通過抑制了MRP2 蛋白表達減少伊立替康及其代謝產物從膽汁向小腸的排泄，進而減少SN-38 在小腸的暴露而改善伊立替康所導致的腹瀉，Guan 等［15］研究同樣發現生姜瀉心湯也能下調MRP2 表達，與本研究結果一致。

綜上所述，大補脾湯能緩解伊立替康所導致的小鼠腹瀉，其可能是通過改善腸道菌群失衡，抑制大腸桿菌繁殖，進而降低細菌β-葡萄糖醛酸苷酶的產生和MRP2 的表達，從而減少SN-38G 轉化為毒性物質SN-38 在小腸的暴露。