加味宮外孕Ⅱ號方對人絨毛膜滋養層細胞凋亡的影響

鄭文蘭，范 敏，文曉敏

（1.貴州中醫藥大學第一附屬醫院婦科，貴州 貴陽 550001； 2.貴陽市花溪區中醫院婦科，貴州 貴陽 550025）

異位妊娠是婦科常見病，其中輸卵管妊娠占95% 以上［1］。祖國醫學認為異位妊娠的主要病機是少腹血瘀實證，治療以活血化瘀消癥殺胚為法。研究顯示化瘀消癥殺胚中藥能夠誘導人輸卵管妊娠滋養細胞凋亡［2］。本課題組前期研究顯示，加味宮外孕Ⅱ號方可能通過降低早孕大鼠滋養細胞Bcl-2／Bax 比值及改變滋養細胞的形態與超微結構達到殺胚目的［3-4］，與文獻報道相一致，但中醫藥介導滋養細胞凋亡的分子機制尚不清楚。calpain-1 與caspase-12 是內質網應激（ERS）誘導凋亡途徑中的重要分子，有研究指出ERS 可通過激活caspase-12 信號通路誘導滋養細胞凋亡［5］，由此推測加味宮外孕Ⅱ號方可能導致過度ERS，激活caspase-12 信號通路促使滋養葉細胞凋亡。報道顯示輸卵管妊娠滋養細胞在形態學、生長能力和侵襲能力方面與宮內早孕滋養細胞無明顯差異，提出宮內妊娠滋養細胞可代替輸卵管妊娠滋養細胞進行實驗研究［6］。本實驗以人絨毛膜滋養層細胞系HTR-8／SVneo 代替異位妊娠滋養細胞來探討加味宮外孕Ⅱ號方治療異位妊娠的機理，為中醫藥保守治療異位妊娠提供理論依據。

1 材料

1.1 細胞及實驗動物 HTR-8／SVneo 人絨毛膜滋養層細胞系由武漢華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院提供。SPF 級雌性SD 大鼠36 只，體質量180～220 g，由湖北省實驗動物研究中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK（鄂）2015-0018，本實驗通過湖北省實驗動物管理與使用委員會批準（編號20182901）。

1.2 藥物 加味宮外孕Ⅱ號方由丹參15 g、赤芍15 g、桃仁9 g、三棱9 g、莪術9 g、蜈蚣4 g、全蝎6 g、土鱉蟲10 g、紫草25 g 組成；注射用甲氨蝶呤，廣東嶺南制藥有限公司生產，批號872016，規格0.1 g／支，上述藥物均購于貴州省中醫院。

1.3 試劑與儀器 RPMI 1640 培養基、胎牛血清（美國Gibco 公司，批號11875-093、10091-148）；CCK-8 細胞增殖試劑盒（合肥白鯊生物科技有限公司，批號BS350B）；BCA 蛋白定量試劑盒、Fluo-3 AM Ca2＋熒光探針（上海碧云天生物技術有限公司，批號P0010、S1056）；兔抗calpain-1 多克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP（武漢博士德生物工程有限公司，批號BA0679、BA1054）；兔抗caspase-12 多克隆抗體（英國Abcam 公司，批號ab62484）；細胞凋亡試劑盒AnnexinV-APC／7-AAD（天津三箭生物技術股份有限公司，批號AO2001-11A-H）；逆轉錄及熒光定量試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號R101-01／02、Q111-02）；引物由武漢擎科生物技術有限公司合成。Multiskan MK3 型酶標儀購于美國Thermo 公司；QuantStudio 6 型實時熒光定量PCR 儀購于美國ABI 公司；CytoFLEX 型流式細胞儀購于美國Beckman 公司。

2 方法

2.1 加味宮外孕Ⅱ號方藥液制備 上述中藥材經混合浸泡、水煎、過濾、濃縮，制成生藥量3 g／mL 的藥液，保存于4 ℃冰箱備用。

2.2 動物分組及給藥 36 只大鼠采用隨機數字表法分為6組，即陰性對照組，中藥（加味宮外孕Ⅱ號方）低、中、高劑量組，西藥（甲氨蝶呤）組及中西藥結合組（中劑量加味宮外孕Ⅱ號方＋甲氨蝶呤）。所有大鼠適應性喂養3 d后開始給藥，參考人與大鼠等效劑量換算公式［7］，中藥低、中、高劑量組分別灌胃給予12、24、48 g／kg 加味宮外孕Ⅱ號方；陰性對照組灌胃給予等量生理鹽水；西藥組與中西藥結合組分別灌胃給予生理鹽水和24 g／kg 加味宮外孕Ⅱ號方，每天灌胃1 次，連續8 d，在第8 天灌胃后均一次性肌肉注射7.775 mg／kg 甲氨蝶呤。

2.3 含藥血清制備 每組大鼠分別于第8 天末次給藥1 h后，水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟采血，靜置2 h，3 000 r／min 離心12 min，吸取血清，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，56 ℃水浴滅活30 min，將同組所有大鼠的血清混合，分裝后置于－80 ℃冰箱備用。

2.4 HTR-8／SVneo 細胞培養及給藥 用含10%胎牛血清的完全培養基重懸細胞，接種到培養皿中，輕揉吹打混勻，37 ℃、5% CO2條件下培養，當細胞融合度達到80%～90%時，按1∶3 比例進行傳代培養。取對數生長期細胞以5×105／mL 密度接種于6 孔板中，培養過夜，棄培養液，更換RPMI 1640 培養基，加入對應組別的10%含藥血清，同時設置僅添加細胞培養基的HTR-8／SVneo 細胞作為空白對照組，以排除灌胃生理鹽水組大鼠血清對細胞的異常影響。

2.5 CCK-8 法檢測HTR-8／SVneo 細胞增殖能力 取對數生長期HTR-8／SVneo 細胞，按每孔8×103個的密度接種于96孔板中，每孔200 μL，置于37 ℃培養箱中培養24 h，棄培養液，分別加入5%、10%、15% 含藥血清繼續培養24 h，然后每孔加入20 μL CCK-8，輕搖混勻，37 ℃培養箱中孵育4 h，酶標儀檢測各孔于450 nm 波長處吸光度（A）值，以此確定藥物作用于細胞的最佳體積分數。細胞增殖抑制率＝（A對照－A實驗）／（A對照－A空白）×100%。

2.6 指標檢測 各組細胞分別與對應的含藥血清共培養24 h，收集細胞，用于以下指標檢測。

2.6.1 流式細胞術檢測細胞凋亡率 按照AnnexinV-APC／7-AAD 細胞凋亡試劑盒說明書操作，加入2 μL AnnexinVAPC 混勻后再加入2 μL 7-AAD，室溫避光反應15 min，流式細胞儀上機檢測。細胞凋亡率＝早期凋亡細胞比例＋晚期凋亡細胞比例。

2.6.2 Ca2＋熒光探針檢測胞漿Ca2＋水平 按Fluo-3 AM 試劑說明書，加入Fluo-3 AM（終濃度5 μmol／L），置于37 ℃培養箱，避光孵育30 min，PBS 潤洗細胞2 次，1 500 r／min離心3 min，加500 μL PBS 重懸，流式細胞儀檢測熒光強度，激發波長為488 nm，發射波長為525 nm，以熒光指數反映胞漿Ca2＋水平。

2.6.3 Western blot 法檢測calpain-1、caspase-12 蛋白表達 提取總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性10 min，冷卻至室溫，于－20 ℃保存。SDS-聚丙烯酰胺凝膠上樣后電泳分離，轉膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，一抗calpain-1（1∶500）、caspase-12（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜5 次，HRP 標記二抗（1∶5 000）37 ℃孵育2 h，TBST 洗膜5次，ECL 化學發光試劑曝光，X 膠片顯影定影，BandScan軟件分析膠片灰度值。

2.6.4 RT-qPCR 法檢測calpain-1、caspase-12 mRNA 表達 加入TRIzol 冰上裂解10 min 提取總RNA，微量分光光度計檢測RNA 的純度和濃度，置于－80 ℃保存，用于逆轉錄。RNA 逆轉錄合成cDNA，反應條件為25 ℃ 5 min，50 ℃15 min，85 ℃5 min，4 ℃10 min；配制20 μL 體系進行基因擴增，擴增條件為50 ℃2 min，95 ℃10 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，40 個循環。以2－ΔΔCT法進行分析。GAPDH正向序列5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′，反向序列5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′；caspase-12 正向序 列 5′-CATCCAACGGTGTTCTGGTC-3′，反向序列 5′-TTGCCTGCAATTTGAGCTGT-3′；calpain-1 正向序列 5′-GGGTCCCAATTCCTCCAAGA-3′，反向序列5′-CTGGAAATGG AAGATGCCGG-3′。

2.7 統計學分析 通過GraphPad Prism 5.0 軟件進行處理，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 加味宮外孕Ⅱ號方對HTR-8／SVneo 細胞增殖能力的影響 與陰性對照組比較，各含藥血清組細胞增殖抑制率增加（P＜0.05），且呈劑量依賴性，對HTR-8／SVneo 細胞具有增殖抑制作用。10% 含藥血清作用細胞24 h，中藥高劑量組細胞抑制率大于50%，為避免含藥血清濃度過大引起細胞毒性，本實驗確定10%含藥血清作用于細胞24 h 為最佳，見表1。

表1 各組HTR-8／SVneo 細胞增殖抑制率比較（±s， n ＝3）

表1 各組HTR-8／SVneo 細胞增殖抑制率比較（±s， n ＝3）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05。

3.2 加味宮外孕Ⅱ號方對HTR-8／SVneo 細胞凋亡率的影響 空白對照組與陰性對照組比較無差異（P＞0.05）；各給藥組細胞凋亡率均高于陰性對照組（P＜0.05），其中中藥各劑量組作用呈劑量依賴性（P＜0.05）；中藥高劑量組細胞凋亡率高于西藥組（P＜0.05），與中西藥結合組比較無差異（P＞0.05）；西藥組與中西藥結合組比較無差異（P＞0.05），見表2、圖1。

圖1 各組HTR-8／SVneo 細胞凋亡率比較

表2 各組HTR-8／SVneo 細胞凋亡率及胞漿內Ca2＋水平比較（±s， n＝3）

表2 各組HTR-8／SVneo 細胞凋亡率及胞漿內Ca2＋水平比較（±s， n＝3）

與陰性對照組比較，*P ＜0.05；與中藥低劑量組比較，▲P ＜0.05；與中藥中劑量組比較，□P ＜0.05；與中藥高劑量組比較，△P＜0.05。

3.3 加味宮外孕Ⅱ號方對HTR-8／SVneo 細胞胞漿內Ca2＋水平的影響 空白對照組與陰性對照組比較無差異（P＞0.05）；與陰性對照組比較，中藥低劑量組細胞胞漿內Ca2＋水平無明顯上升（P＞0.05），但中、高劑量組、西藥組及中西藥結合組細胞胞漿內Ca2＋水平升高（P＜0.05）；中藥高劑量組細胞胞漿內Ca2＋水平高于西藥組及中西藥結合組（P＜0.05）；西藥組與中西藥結合組比較無差異（P＞0.05），見表2、圖2。

圖2 各組HTR-8／SVneo 細胞胞漿內Ca2＋水平流式圖

3.4 加味宮外孕Ⅱ號方對HTR-8／SVneo 細胞calpain-1、caspase-12 蛋白表達的影響 空白對照組與陰性對照組比較無差異（P＞0.05）；與陰性對照組比較，各給藥組細胞calpain-1 蛋白表達均升高（P＜0.05）；中藥高劑量組細胞calpain-1 蛋白表達高于低、中劑量組、西藥組及中西藥結合組（P＜0.05）；中西藥結合組細胞calpain-1 蛋白表達高于西藥組（P＜0.05）。與陰性對照組比較，中藥低、中劑量組caspase-12 蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），高劑量組、西藥組及中西藥結合組caspase-12 蛋白表達升高（P＜0.05）；與西藥組和中藥高劑量組比較，中西藥結合組caspase-12 蛋白表達量升高更明顯（P＜0.05），見表3、圖3。

圖3 各組HTR-8／SVneo 細胞calpain-1、caspase-12 蛋白條帶圖

表3 各組HTR-8／SVneo 細胞calpain-1、caspase-12 蛋白表達比較（±s， n＝3）

表3 各組HTR-8／SVneo 細胞calpain-1、caspase-12 蛋白表達比較（±s， n＝3）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05；與中藥高劑量組比較，△P＜0.05；與西藥組比較，●P＜0.05。

3.5 加味宮外孕Ⅱ號方對HTR-8／SVneo 細胞calpain-1、caspase-12 mRNA 表達的影響 空白對照組與陰性對照組比較無差異（P＞0.05）；與陰性對照組比較，各給藥組calpain-1 mRNA 表達均升高（P＜0.05）；中藥高劑量組calpain-1 mRNA 表達高于低、中劑量組及西藥組（P＜0.05）；中西藥結合組與中藥高劑量組比較無顯著差異（P＞0.05）。與陰性對照組比較，中藥高劑量組、西藥組及中西藥結合組caspase-12 mRNA 表達升高（P＜0.05）；而中藥低、中劑量組無明顯變化（P＞0.05）；中西藥結合組與中藥高劑量組比較無顯著差異（P＞0.05），見表4。

表4 各 組 HTR-8／SVneo 細 胞 calpain-1、 caspase-12 mRNA 表達比較（±s， n＝3）

表4 各 組 HTR-8／SVneo 細 胞 calpain-1、 caspase-12 mRNA 表達比較（±s， n＝3）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05；與中藥低劑量組比較，▲P＜0.05；與中藥中劑量組比較，□P ＜0.05；與中藥高劑量組比較，△P＜0.05。

4 討論

加味宮外孕Ⅱ號方中丹參、赤芍、桃仁、三棱、莪術有活血化瘀消癥之功效；蜈蚣、全蝎、土鱉蟲、紫草有破血、通絡、損害胚胎的作用。現代藥理研究認為丹參、赤芍、桃仁、三棱、莪術能促進盆腹腔胚胎組織及包塊的吸收；配伍蜈蚣、全蝎、土鱉蟲、紫草可抑制滋養細胞的生長與分化，致其變性壞死，降低胚胎活性，增強殺胚作用，且能改善輸卵管通暢度［8-9］。為驗證加味宮外孕Ⅱ號方對細胞凋亡影響的劑量依賴性，本研究比較了不同劑量中藥組對細胞凋亡的影響。

本研究發現，中藥各劑量組、西藥組和中西藥結合組細胞凋亡率升高，說明加味宮外孕Ⅱ號方及甲氨蝶呤均可以誘導HTR-8／SVneo 細胞凋亡，間接提示該方可以降低滋養細胞對輸卵管管壁的增殖和侵襲能力，減少病灶破裂風險，保留輸卵管的完整性。中藥高劑量組、西藥組及中西藥結合組Ca2＋水平較陰性對照組上升了約2 倍，提示經中藥與西藥處理后細胞內Ca2＋水平增加，鈣超載。Ca2＋作為細胞內第二信使，當內質網腔內集聚過多未折疊及錯誤折疊蛋白，可引起大量Ca2＋外流，胞質Ca2＋水平升高，鈣超載，calpain 被激活，發揮蛋白水解功能，產生細胞凋亡級聯反應［10］。研究顯示中藥各劑量組作用呈劑量依賴性，細胞凋亡率與胞漿內Ca2＋水平有升高趨勢。

calpain 屬于鈣依賴性半胱氨酸蛋白水解酶家族成員，根據激活時所需Ca2＋水平差異，分為calpain-1（μ-calpain）和calpain-2（m-calpain），對細胞凋亡、細胞骨架重塑及信號轉導有重要作用［11］，正常狀態下以無活性的酶原形式存在于組織和細胞中，由Ca2＋紊亂激活，多項研究提示calpain-1 與細胞凋亡密切相關［12-13］，calpain-1 在滋養細胞凋亡中起作用［14］。caspase-12 是caspase 家族中唯一僅在ERS 反應時激活的蛋白，在死亡受體途徑及線粒體途徑中不發生活化［15］，是ERS 反應性凋亡的關鍵分子。caspase-12 被激活的機制之一是Ca2＋依賴的calpain 水解活化，calpain 從胞質進入內質網，剪切激活caspase-12 前體，進一步活化caspase-12，最終通過激活下游靶分子caspase-3 促進細胞凋亡［16-17］。進一步研究顯示，經中藥與西藥含藥血清處理24 h 后，calpain-1、caspase-12 蛋白及mRNA 相對表達量均上調，說明其參與了調控ERS 反應，被過度激活，說明加味宮外孕Ⅱ號方含藥血清作用于人滋養細胞后使細胞發生過度ERS 反應，從而加速細胞凋亡。中藥和甲氨蝶呤發揮促滋養葉細胞凋亡作用可能是依賴caspase-12 途徑；再結合HTR-8／SVneo 細胞的凋亡率及Ca2＋水平變化，提示加味宮外孕Ⅱ號方和甲氨蝶呤可能通過上調胞漿內Ca2＋水平，調控細胞caspase-12 通路中關鍵信號分子的表達促滋養葉細胞凋亡而終止妊娠。從研究結果看，中藥高劑量組與西藥組及中西藥結合組效果相近，而甲氨蝶呤副作用大，臨床上用于異位妊娠保守治療的不良反應時有報道，除肝腎、皮膚毒性外，對生殖系統可產生致畸、致突變作用［18-19］，因此，對于今后異位妊娠保守治療用藥選擇上是否可以首選中藥，并根據患者情況適當增加中藥劑量，制定個體化最佳用藥方案具有參考價值。

綜上所述，加味宮外孕Ⅱ號方能夠誘導滋養葉細胞凋亡，且高劑量作用最佳，其機制可能是通過激活caspase-12信號通路，使細胞內質網發生過度應激反應，上調促凋亡因子的表達而加速滋養細胞的凋亡。