黃芪甲苷通過NF-κB／NLRP3 信號通路減輕肺動脈高壓大鼠的炎癥反應

孫 洋，王洪新

（錦州醫科大學心腦血管藥物研究重點實驗室，遼寧 錦州 121001）

肺動脈高壓的特征是血管過度收縮和閉塞性血管重塑，其組織病理學特征包括肺血管的內膜和外膜層增厚，以及血管閉塞和叢狀病變［1-2］，研究表明，在其肺血管系統和右心室中，炎癥因子水平有所增加［3］，提示炎癥在肺動脈高壓中發揮著重要作用。NLRP3 炎性小體是一種多蛋白促炎復合物，由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）和位于細胞質中的caspase-1 組成［4］。在肺動脈高壓大鼠的肺組織中，NF-κB 的表達增加，此外，終末期特發性肺動脈高壓患者的肺血管中NF-κB 也被激活，這說明NF-κB 的激活可能促進了該疾病的發展［5］。

黃芪是我國傳統珍貴藥材，具有抗菌、止汗、消炎、利尿和滋補的作用，皂苷、類黃酮和多糖等成分被認為是黃芪的主要活性成分［6］。黃芪甲苷是從黃芪中提取的四環三萜皂苷，對多種心血關疾病具有保護作用［7］，已有研究表明，黃芪甲苷對肺動脈高壓具有保護作用［8］，但具體改善機制尚不清楚。因此，本實驗在體內和體外水平上，分別探討黃芪甲苷對肺動脈高壓的保護作用和潛在機制。

1 材料

1.1 試劑與藥物 黃芪甲苷（純度≥98.0%，南京景竹生物科技有限公司）。野百合堿、炎癥小體NLRP3 抑制劑MCC950、核轉錄因子NF-κB 抑制劑Bay11-7082（美國Sigma 公司，貨號 315220、538120、B5556）；GAPDH、NLRP3、NF-κB 抗體（美國Proteintech 公司，貨號60004-1-Ig、19771-1-AP、14220-1-AP）；FITC 熒光染料（北京鼎國生物技術有限責任公司，貨號CSB-L05598m）；Alexa Fluor 488 熒光二抗、BeyoClickTMEdU-488 細胞增殖檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號A0423、C0071S）。

1.2 儀器 半干轉轉膜儀、化學發光成像儀（美國Bio-Rad 公司）；NM-9602G 型酶標分析儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；DMI3000B 型顯微鏡（德國Leica 公司）；制冰機（日本大阪松下電器產業株式會社）。

1.3 動物和細胞 健康雄性SD 大鼠60 只，體質量（200±10）g，由錦州醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK（遼）2014-0004。人肺動脈內皮細胞（HPAECs），購自通派（上海）生物科技有限公司。

2 方法

2.1 分組和給藥 將60 只大鼠隨機分為對照組、模型組、MCC950 組（10 mg／kg）、Bay11-7082 組（5 mg／kg）、黃芪甲苷組（40、80 mg／kg），通過單次腹腔注射野百合堿建立肺動脈高壓模型，黃芪甲苷組大鼠連續灌胃40、80 mg／kg黃芪甲苷28 d，MCC950 組（10 mg／kg）和Bay11-7082 組（5 mg／kg）大鼠腹腔注射相應劑量藥物。

HPAECs 細胞在含10%胎牛血清的ECM 培養基中，于37 ℃、5%CO2條件下培養。HPAECs 細胞用野百合堿吡咯誘導24 h，然后用MCC950（10 μmol／L）、Bay 11-7082（10 μg／mL）、黃芪甲苷（50、100 μmol／L）分別處理30 min。

2.2 右心室導管插管法檢測血流動力學 使用BL-420S 生物信號采集和分析系統，通過右心室導管插管測定右心室收縮壓和平均肺動脈壓。分別測定左心室壁（LV）、室間隔（S）和右心室壁（RV），右心肥厚指數表示為右心室與左心室加上隔膜的重量比，公式為右心肥厚指數＝RV／（LV＋S）。

2.3 ELISA 法檢測大鼠血清TNF-α 水平以及HPAECs 細胞IL-6、TNF-α 水平 按照ELISA 試劑盒說明書測定大鼠血清TNF-α 水平以及HPAECs 細胞IL-6、TNF-α 水平。

2.4 免疫組化法檢測大鼠肺組織IL-6 蛋白表達 4%多聚甲醛固定肺組織，石蠟包埋，切片，經熱修復、封閉后，IL-6 抗體4 ℃孵育過夜，滴加二抗，DAB 顯色，蘇木素染核，透明后中性樹脂封片。在顯微鏡下觀察到有棕黃色顆粒沉淀即為IL-6 表達，通過Image-Pro Plus 軟件進行分析，蛋白表達為陽性表達面積／總細胞面積。

2.5 免疫熒光法檢測大鼠肺組織NLRP3、NF-κB 蛋白表達 4%多聚甲醛固定肺組織，石蠟包埋，高壓抗原修復，滴加NLRP3、NF-κB 一抗，4 ℃過夜后滴加熒光二抗，DAPI 染核，在熒光倒置顯微鏡下觀察，通過Image-Pro Plus 軟件進行分析，蛋白表達為熒光光密度總和／面積總和。

2.6 EdU-488 增殖試劑盒檢測HPAECs 細胞增殖情況 按照試劑盒說明書進行操作，通過Image-Pro Plus 軟件進行分析，細胞增殖率為EdU-488 光密度總和／面積總和。

2.7 Western blot 法檢測HPAECs 細胞NLRP3、NF-κB 蛋白表達 提取細胞總蛋白后BCA 法測定濃度，將樣品蛋白通過SDS-PAGE 凝膠進行分離，并轉移至PVDF 膜上，封閉1.5 h，然后與NLRP3、NF-κB 抗體4 ℃孵育過夜，與二抗室溫孵育2 h，ECL 法顯色，曝光，用Image J 軟件分析結果。

2.8 統計學分析 通過SPSS 25.0 軟件進行處理，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 黃芪甲苷對肺動脈高壓大鼠血流動力學和體質量的影響 與對照組比較，模型組大鼠右心肥厚指數、右心室收縮壓和平均肺動脈壓均升高（P＜0.01），體質量降低（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷組、MCC950 組和Bay11-7082 組大鼠右心肥厚指數、右心室收縮壓和平均肺動脈壓均降低（P＜0.01），體質量升高（P＜0.01），說明黃芪甲苷對肺動脈高壓大鼠的肺動脈高壓有改善作用，見圖1。

圖1 黃芪甲苷對肺動脈高壓大鼠血流動力學和體質量的影響（±s， n＝6，1 mmHg＝0.133 kPa）

3.2 黃芪甲苷對肺動脈高壓大鼠血清TNF-α 水平和肺組織IL-6 表達的影響 與對照組比較，模型組大鼠血清TNFα 水平和肺組織IL-6 表達均升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷組、MCC950 組和Bay11-7082 組大鼠血清TNF-α 水平和肺組織IL-6 表達均降低（P＜0.01），說明黃芪甲苷能夠減輕肺動脈高壓大鼠炎癥反應，見圖2。

圖2 黃芪甲苷對肺動脈高壓大鼠血清TNF-α 水平和肺組織IL-6 表達的影響（±s， n＝6）

3.3 黃芪甲苷對肺動脈高壓大鼠NF-κB／NLRP3 信號通路的影響 與對照組比較，模型組大鼠肺組織NLRP3、NFκB 蛋白表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷組、MCC950 組和Bay11-7082 組大鼠肺組織NLRP3、NFκB 蛋白表達均降低（P＜0.01），說明黃芪甲苷對肺動脈高壓大鼠的保護作用可能通過抑制NF-κB／NLRP3 信號通路，見圖3。

圖3 黃芪甲苷對肺動脈高壓大鼠NF-κB／NLRP3 信號通路的影響（±s， n＝6，×400）

3.4 黃芪甲苷對HPAECs 細胞增殖的影響 與對照組比較，模型組HPAECs 細胞增殖率升高（P＜0.01）；與模型組比較較，黃芪甲苷組、MCC950 組和Bay11-7082 組HPAECs 細胞增殖率降低（P＜0.01），說明黃芪甲苷能改善HPAECs 細胞增殖情況，見圖4。

圖4 黃芪甲苷對HPAECs 細胞增殖的影響（±s， n＝6，×400）

3.5 黃芪甲苷對HPAECs 細胞炎癥因子TNF-α、IL-6 水平的影響 與對照組比較，模型組HPAECs 細胞TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.01）；與模型組比較較，黃芪甲苷組、MCC950 組和Bay11-7082 組HPAECs 細胞TNF-α、IL-6 水平降低（P＜0.01），見圖5。

圖5 黃芪甲苷對HPAECs 細胞TNF-α、IL-6 水平的影響（±s， n＝6）

3.6 黃芪甲苷對HPAECs 細胞NF-κB／NLRP3 信號通路的影響 與對照組比較，模型組HPAECs 細胞NF-κB、NLRP3 蛋白表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷組、MCC950 組和Bay11-7082 組HPAECs 細胞NF-κB、NLRP3 蛋白表達降低（P＜0.01），見圖6。

圖6 黃芪甲苷對HPAECs 細胞NF-κB／NLRP3 信號通路的影響（±s， n＝6）

4 討論

野百合堿可引起肺動脈高壓，單次腹腔注射可建立肺動脈高壓動物模型。在細胞色素P-450（CYP3A4）的作用下，野百合堿在肝臟代謝為吡咯烷（野百合堿吡咯），選擇性地損傷肺動脈內皮細胞，最終引起肺動脈高壓［9］。內皮細胞增殖和炎癥參與了肺動脈高壓疾病發展的進程［10］。臨床前研究和人體試驗表明，炎癥在肺動脈高壓中發揮著重要作用。細胞炎癥因子水平的升高與肺動脈高壓患者不良預后有關［11］，在肺動脈高壓患者的血清中，TNF-α、IL-6 水平升高［12-13］；在肺動脈高壓大鼠的肺組織中，NF-κB表達增加，而NF-κB 的激活可能促進了該疾病的發展［14］。NF-κB 的活化能激活NLRP3 炎性小體，并能誘導NLRP3和pro-IL-1β 的轉錄［13］，研究證實，NLRP3 在肺動脈高壓起著重要作用，參與了肺動脈高壓的疾病發展［15］。由此推測黃芪甲苷可能通過NF-κB／NLRP3 信號通路來減輕肺動脈高壓大鼠的炎癥反應。

實驗結果表明，黃芪甲苷組能夠降低肺動脈高壓大鼠右心室收縮壓、平均肺動脈壓和右心肥厚指數，改善肺動脈高壓大鼠體質量降低情況，說明黃芪甲苷可以改善肺動脈高壓大鼠血流動力學和生活質量。實驗還發現，黃芪甲苷可以改善HPAECs 細胞的增殖情況，下調肺動脈高壓大鼠血清、肺組織和HPAECs 細胞中IL-6、TNF-α 水平和NFκB、NLRP3 表達，說明黃芪甲苷可在體內和體外減輕野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠或HPAECs 細胞的炎癥反應。進一步實驗表明，與模型組比較，MCC950 組和Bay11-7082組IL-6、TNF-α 水平和NF-κB、NLRP3 蛋白表達降低，提示MCC950 和Bay11-7082 能夠減輕肺動脈高壓大鼠和HPAECs 細胞中的炎癥反應，并且這種作用與黃芪甲苷類似。

綜上所述，黃芪甲苷能夠減輕肺動脈高壓大鼠的炎癥，其機制可能是通過NF-κB／NLRP3 信號通路發揮作用。