補虛解毒化瘀方通過調控NCC／HIF-1α 信號通路對梗阻性腎病大鼠的作用

趙綺悅高曉萌劉令今劉子騫陳格格許慶友

（1.河北中醫學院研究生學院，河北 石家莊 050091； 2.河北省中西醫結合肝腎病證研究重點實驗室，河北 石家莊 050091； 3.河北中醫學院中西醫結合學院，河北 石家莊 050091）

目前，梗阻性腎病在我國農村慢性腎臟病中發病率居首位［1］，可表現為雙側或單側梗阻，單側梗阻進展為腎衰竭與對側腎臟的失代償有關。既往研究表明，單側腎梗阻刺激醛固酮的過度分泌，激活鹽皮質激素受體介導另一側腎損傷［2］，課題組研究也發現腎小管上皮細胞-肌成纖維化轉變也參與這一過程。腎小管上皮細胞表型轉化與鈉氯協同轉運蛋白（NCC）的過表達、醛固酮誘導的組織缺血缺氧有關［3-4］，低氧誘導因子刺激轉化生長因子-β1（TGF-β1）分泌增多會進一步誘導小管上皮細胞轉化［5］。

補虛解毒化瘀方是本課題組多年來用于治療慢性腎臟病的經驗方，前期研究已經證實該方具有改善梗阻性腎病對側腎臟腎小球硬化，減緩腎臟纖維化發生發展的作用［6］。本實驗旨在觀察該方調控NCC／HIF-1α 信號通路對單側輸尿管梗阻大鼠對側腎臟小管上皮細胞表型轉化的作用，以期為中醫藥防治慢性腎臟病提供新思路。

1 材料

1.1 實驗動物 成年雄性SD 大鼠，7 周齡，體質量（200±20）g，購自河北醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK（冀）2018-004。大鼠飼養在12 h／12 h 光暗循環、溫度（22±1）℃的房間，可自由獲取食物和水。

1.2 儀器 RM2245 型石蠟切片機、CTS SP8 型激光共聚焦掃描顯微鏡（德國Leica 公司）；ODYSSEY 雙色紅外激光成像掃描儀（美國LI-COR 公司）；半干轉膜儀（美國Bio-Rad 公司）；VANOX DM-10AD 型顯微照相儀（日本Olympus 公司）。

1.3 試劑與藥物 補虛解毒化瘀方由生黃芪20 g（批號403196T）和地龍（批號 6033291）、醋鱉甲（批號6013581）、赤芍（批號311400T）、黃芩（批號6033511）、金銀花（批號6020961）各10 g 組成，均為廣東一方制藥有限公司生產的免煎顆粒。依普利酮（批號2543009，輝瑞公司生產），由日本國際醫療福祉大學下澤達雄教授惠贈，由日本Research Diets Inc 公司根據動物攝食量和100 mg／kg 藥物劑量以1.25 g／kg 的比例添加到飼料中［7-8］。SGK-1 抗 體（美 國 Affinity Biosciences 公 司，批號86018726）；NCC、HIF-1α、Vimentin、α-SMA、β-actin 抗體（英國Abcam 公司，批號GR3274565-3、GR3319739-1、GR3186827-16、GR3252482-10、GR305367-39）；TGF-β1 抗體（美國Bioworld 公司，批號AA56133）；GAPDH 抗體（美國Epitomics 公司，批號Y123103P）。

2 方法

2.1 造模方法及給藥 將大鼠隨機分為假手術組、模型組、依普利酮組和中藥組，每組各10 只。采用單側輸尿管結扎法建立梗阻性腎病模型，大鼠吸入異氟烷麻醉后，分離左側輸尿管，于輸尿管上1／3 與下1／3 處結扎并剪斷中1／3 處輸尿管，縫合皮膚；假手術組僅游離輸尿管。單側輸尿管結扎術后，依普利酮組每天給予含有依普利酮的加工飼料進行喂養，中藥組按照《實驗動物科學》［9］劑量換算方法給予中藥免煎顆粒，按1.92 g／kg（相當于11.7 g／kg生藥量）劑量加到3 mL 蒸餾水中，每天灌胃1 次，藥物干預10 d 后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉進行麻醉，股動脈取血，摘取梗阻對側的腎臟（右側腎臟），沿縱軸切開，一部分組織于4%多聚甲醛固定，石蠟或OCT 包埋，用于組織病理學的檢測；另一部分放入液氮中快速凍存，隨即置于－80 ℃冰箱保存備用，用于檢測相關蛋白指標。

2.2 對側腎組織Masson 染色及免疫組化檢測 常規制備腎組織病理切片，Masson 染色觀察腎組織病理改變；免疫組化檢測α-SMA、Vimentin、SGK-1、HIF-1α、TGF-β1 表達。大鼠腎組織進行免疫組化染色后，以間質中棕色黃染部分為陽性表達，SGK-1 和HIF-1α 在細胞核內表達，采用Image Pro Plus 軟件對圖片進行分析［6］，計算陽性表達面積與腎組織總面積的比值，取平均值。

2.3 免疫熒光法檢測NCC 表達 大鼠腎組織進行免疫熒光染色后，以綠色熒光為陽性表達，采用Image Pro Plus 軟件對圖片進行分析，計算陽性表達面積與腎組織總面積的比值，取平均值。

2.4 Western blot 法檢測相關蛋白表達 取新鮮腎臟組織100 mg 于400 μL 含蛋白酶及磷酸酶抑制劑的裂解液中進行勻漿，4 ℃、16 000×g離心15 min 后收集上清液，測定蛋白濃度，用10% SDS-PAGE 凝膠分離50 μg 蛋白，轉移到PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌，分別與相應的二抗室溫孵育1 h，TBST 洗滌，用Odyssey 紅外顯影儀掃描顯影，采集圖像，測量目的蛋白灰度值，并與所得內參進行比較。

2.5 RT-qPCR 法檢測腎臟組織中SGK-1、TGF-β1 mRNA 表達 按照RNA 提取試劑盒說明書提取各組腎組織的總RNA，并采用逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA，采用PCR 試劑盒檢測SGK-1、TGF-β1 mRNA 表達，反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40 個循環。采用2－ΔΔCT法計算SGK-1、TGF-β1 mRNA 相對表達。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

2.6 統計學分析 通過SPSS 25.0 軟件進行處理，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD／SNK 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 補虛解毒化瘀方對大鼠腎組織病理學改變的影響Masson 結果顯示，假手術組腎臟腎間質中僅含有少量纖維成分，且結構清晰；模型組腎間質膠原成分較假手術組增多（P＜0.01）；中藥組和依普利酮組腎間質膠原成分均少于模型組（P＜0.01）。免疫組織化學法結果顯示，假手術組α-SMA 僅在血管中表達，而在腎間質和上皮細胞中未見表達；Vimentin 表達可見于部分遠端小管間質。與假手術組比較，模型組α-SMA 表達增加（P＜0.01），以遠端腎小管和腎間質表達最為明顯；Vimentin 表達增加（P＜0.01），見于遠端小管胞質及腎間質。與模型組比較，中藥組和依普利酮組α-SMA 局部中度表達，間質少量表達，較模型組降低（P＜0.01）；Vimentin 在腎小管間質有表達，較模型組降低（P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組大鼠對側腎組織病理變化及α-SMA、Vimentin 表達（±s， n＝3）

3.2 補虛解毒化瘀方對大鼠腎組織α-SMA、Vimentin 蛋白表達的影響 圖2 顯示，模型組α-SMA、Vimentin 蛋白表達均較假手術組升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組和依普利酮組α-SMA、Vimentin 蛋白表達降低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠對側腎組織α-SMA、Vimentin 蛋白表達（±s， n＝3）

3.3 補虛解毒化瘀方對大鼠腎組織NCC 表達的影響 圖3顯示，假手術組NCC 陽性表達分布在腎遠曲小管管腔親水側；模型組腎遠端小管細胞NCC 表達增強（P＜0.01），亦可見于近端小管；與模型組比較，中藥組和依普利酮組NCC 表達范圍和強度均降低（P＜0.01）。圖4 顯示，模型組NCC 蛋白表達高于假手術組（P＜0.01）；中藥組和依普利酮組NCC 蛋白表達低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 各組大鼠對側腎組織NCC 表達（±s， n＝3）

圖4 各組大鼠對側腎組織NCC 蛋白表達（±s， n＝3）

3.4 補虛解毒化瘀方對大鼠腎組織SGK-1、HIF-1α、TGFβ1 表達的影響 圖5 顯示，假手術組HIF-1α 僅表達于腎小管中，主要見于細胞質內；TGF-β1 主要表達于腎小管上皮細胞，呈弱表達。模型組SGK-1 表達高于假手術組（P＜0.01），其表達主要在遠端腎小管上皮細胞的細胞質中；除腎小管和腎小球外，HIF-1α 表達較假手術組增加（P＜0.01），腎小管可見大量核染色，呈棕黃色顆粒；TGF-β1 表達高于假手術組（P＜0.01），以近曲小管尤為明顯。中藥組和依普利酮組SGK-1 表達強度及范圍較模型組減弱（P＜0.01）；HIF-1α 在腎小管染色較少，主要表達于細胞質，較模型組減弱（P＜0.01）；TGF-β1 表達范圍及強度較模型組減弱（P＜0.01）。

圖5 各組大鼠對側腎組織SGK-1、HIF-1α、TGF-β1 表達比較（±s， n＝3）

圖6 顯示，模型組SGK-1、HIF-1α、TGF-β1 蛋白表達均較假手術組升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，中藥組和依普利酮組SGK-1、HIF-1α、TGF-β1 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖6 各組大鼠對側腎組織SGK-1、HIF-1α、TGF-β1 蛋白表達（±s， n＝3）

3.5 補虛解毒化瘀方對大鼠腎組織SGK-1、TGF-β1 mRNA表達的影響 模型組SGK-1、TGF-β1 mRNA 表達高于假手術組（P＜0.01）；中藥組和依普利酮 組SGK-1、TGF-β1 mRNA 表達低于模型組（P＜0.01），見表2。

表2 各組大鼠對側腎組織SGK-1、 TGF-β1 mRNA 表達比較（±s， n＝4）

表2 各組大鼠對側腎組織SGK-1、 TGF-β1 mRNA 表達比較（±s， n＝4）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

4 討論

近年來，慢性腎臟病發病率明顯升高，已經成為全球關注的公共性問題［1］。國內學者列隊分析177 例梗阻性腎病患者，有25 例在18 個月的隨訪期間進展成為終末期腎病，且有些梗阻性腎病患者即便通過外科手術解除了梗阻癥狀，術后腎功能并未見到明顯改善［10］。基于神經-體液代謝失常，梗阻因素刺激醛固酮分泌增多激活鹽皮質激素受體、上調NCC 表達參與對側腎臟的損傷可能為單側腎臟損傷誘導慢性腎衰竭的機制［2］。

NCC 是醛固酮調節鈉排泄的主要靶點［11］，在鹽敏感性高血壓的形成中發揮著關鍵作用，高鹽及醛固酮刺激可增強其表達［12］。梗阻性腎病模型可誘導醛固酮水平升高，循環至對側腎臟，激活MR／NCC 通路導致水鈉潴留引起組織水腫，導致對側腎臟的低氧損傷而發生一系列病理生理改變［13］。實驗結果顯示，模型組NCC 及HIF-1α 表達上調，給予中藥及醛固酮受體阻斷劑治療后，NCC 及HIF-1α 的表達均有所下調。

腎小管上皮細胞的間充質轉分化（EMT）是腎臟纖維化最為常見的病理改變，有效抑制其轉化可減緩腎臟病的進展［14］。既往研究多關注梗阻側小管上皮細胞的表型轉化，本研究以對側腎臟為對象，研究單側腎臟損傷誘導慢性腎衰竭的部分機制。實驗結果顯示，模型組大鼠對側腎臟上皮細胞表型轉化標志物α-SMA 及Vimentin 表達增強，經依普利酮及中藥治療后，細胞表型轉化減輕。

基于中醫整體觀念及治未病理論，一臟受損可及他臟，單側腎臟損傷日久可以導致對側腎臟受損。本課題結合慢性腎臟病的臨床辯證規律和前期研究基礎，以慢性腎臟病“虛、瘀、毒” 病機為依據，確立補虛解毒化瘀中藥組方。方中黃芪既能補肺固表，防止外邪直中入腎，又可補后天以養先天之腎精；金銀花、黃芩清熱解毒，現代藥理研究亦表明二者具有明顯的抗炎作用［15-16］；赤芍、地龍、醋鱉甲活血祛瘀，軟堅散結，現代藥理學研究表明補益類、活血類、解毒類中藥均有改善腎間質纖維化的作用［17-18］。一方面，黃芪益氣補虛，推動氣血正常運行；另一方面配伍金銀花、黃芩清熱解毒，赤芍、地龍、醋鱉甲軟堅散結，祛瘀利水，共奏補虛解毒、祛瘀通絡之功，從而起到治療梗阻因素介導的損傷同時預防其他臟器因之發生病變的作用。

綜上所述，補虛解毒化瘀方通過調控NCC／ HIF-1α 信號通路，抑制大鼠腎小管上皮細胞表型轉化，抑制Vimentin 及α-SMA 分泌，減緩腎間質纖維化進展。

致謝本實驗主要在河北省中西醫結合肝腎病證重點實驗室完成，在此衷心感謝實驗室全體師生的幫助！