元蘑菌絲發酵多糖對小鼠免疫損傷的保護作用

馮衛紅，姚 瀾，呂建華，潘美晨，范冬雨，李長田

（吉林農業大學食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118）

元蘑Sarcomyxa edulis（Y.C.Dai，Niem el? ＆ G.F.Qin）T.Saito，T.Tonouchi ＆ T.Harada 隸屬于真菌界Fungi，擔子菌門Basidiomycota，蘑菇綱Agaricomycetes，蘑菇目Agaricales，小菇科Mycenaceae，美味扇菇屬Sarcomyxa［1-5］，又名亞側耳［6-7］、凍蘑及黃蘑，在東北地區也叫冬蘑和美味冬菇，是東北的重要栽培菇，地位僅次于猴頭菇和黑木耳，其形態似靈芝，顏色偏黃，也叫“黃靈菇”［8］。元蘑口感好，含有大量蛋白質、氨基酸、維生素和礦物質等營養元素［9-11］，此外其還具有預防動脈硬化、提高機體免疫力、抑制腫瘤增殖等作用［12-14］。酒中放元蘑后直接飲用，有一定藥用價值［15］。元蘑生物活性高，國內外對其多糖在抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等方面作用比較關注［16-18］，對其藥用價值也較為重視［19-20］。因此，本研究探討了元蘑菌絲發酵多糖對環磷酰胺造成免疫損傷小鼠的保護作用。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級昆明小鼠，4 周齡，體質量18～22 g，由四平市鐵西區愛普隆生物科技經銷處提供。

1.2 儀器 H2100R 型高速冷凍離心機（蘇州優格曼機械有限公司）；YW-SYS-20L 型生化培養箱（揚州市培英試驗儀器有限公司）；352 型酶標儀（芬蘭Labsystems 公司）；Milli-Q 型超純水機（美國Millipore 公司）。

1.3 元蘑發酵液多糖 元蘑菌株SE1（編號HMJAU 2016092521），由吉林農業大食藥用菌教育部工程研究中心提供。菌種活化發酵均采用cPDA 培養基，將長勢好的液體菌種按10%左右的接種量接入cPDA 培養基，25 ℃、150 r／min 進行發酵培養12 d。將發酵到多糖含量較高時期的發酵液用旋轉蒸發儀濃縮，溫度60 ℃，多糖-乙醇比為1∶4，過濾后加入無水乙醇。將沉淀的多糖放入50 ℃烘箱進行烘干，得到粗多糖。

2 方法

2.1 造模及分組給藥 60 只小鼠適應性飼養1 周，隨機分為空白組、模型組、陽性組（0.02 mL／kg 黃芪精口服液）和元蘑多糖低、中、高劑量組（50、100、200 mg／kg），給藥組灌胃給予相應劑量藥物，空白組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，第5 天灌胃結束后，連續3 d 腹腔注射80 mg／kg環磷酰胺以建立免疫抑制小鼠模型，空白組腹腔注射等體積生理鹽水，并繼續灌胃給藥12 d。

2.2 ELISA 法檢測血清細胞因子水平 灌胃結束后，小鼠稱定體質量，眼球取血，3 000 r／min 離心10 min，分離得上層血清，按照ELISA 試劑盒說明書檢測血清IL-6、IL-1β、TNF-α 水平，用酶標儀于492 nm 波長處測定吸光度，根據標準曲線計算IL-6、IL-β、TNF-α 水平。

2.3 小鼠胸腺和脾臟指數計算 小鼠處死后用75%酒精消毒5 min，沿腹部正中線剖腹并取出胸腺和脾臟，去除筋膜組織，漂洗后吸干水分稱重，以胸腺或脾臟質量和體質量的比值表示胸腺和脾臟指數。

2.4 小鼠脾臟淋巴細胞增殖檢測 各組小鼠脾臟放入有200 目篩網的平板內，用1.5 mL RPMI-1640 培養基沖洗研磨，細胞懸液裝入1.5 mL 離心管，1 500 r／min 離心5 min，紅細胞裂解液重復裂解2 次，離心后用培養基洗滌，沉淀重懸于2 mL 含10%胎牛血清的培養基中，臺盼藍染色后調整各組細胞密度至1×106／mL，接種于96 孔板，每孔100 μL，再加100 μL ConA 溶液；另設對照孔，僅加200 μL 培養基，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養48 h，MTT 法檢測OD570值，計算各組脾臟淋巴細胞增殖率。

2.5 糞便氨含量檢測 參考文獻［21-22］報道，用靛酚藍比色法測定糞便氨含量。取約50 mg 結腸糞便樣品，加NH4＋溶解液和蛋白沉淀液各500 μL，混勻，5 000 r／min 離心2 min，取200 μL 上清液加入含3.8 mL 超純水的試管中，即樣品溶液。96 孔板每孔加入200 μL 樣品溶液，每組設3 個復孔，對照液（僅無糞便，其他添加溶液同樣品液）調零，用酶標儀測定樣品液吸光度值，根據糞便質量、稀釋倍數等換算關系計算糞便樣品中的氨含量，以μmol／g 糞便表示。

2.6 HE 和AB-PAS 染色觀察小腸組織病理結構 取小鼠小腸組織，經固定、脫水、包埋、切片后，行常規HE 和AB-PAS 染色，觀察小腸組織病理形態及杯狀細胞數量［23-24］。

2.7 統計學分析 通過SPSS 26 軟件進行處理，數據以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 元蘑菌絲發酵多糖對免疫抑制小鼠胸腺和脾臟指數的影響 胸腺調節免疫器官、免疫細胞［25］；脾臟產生免疫應答，合成活性物質［26］。表1 顯示，與空白組比較，模型組小鼠胸腺和脾臟指數均降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，元蘑多糖低劑量組小鼠脾臟指數升高（P＜0.05）。

表1 各組小鼠胸腺、脾臟指數比較（±s， n＝10）

表1 各組小鼠胸腺、脾臟指數比較（±s， n＝10）

注：與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 元蘑菌絲發酵多糖對免疫抑制小鼠細胞因子水平的影響 細胞因子一般可分為Th1、Th2、Th17、Treg4 種類型，Th2 型主要協助合成抗體［27］，IL-1β 可以誘發炎癥反應及調節多種免疫功能［27-28］。表2 顯示，與空白組比較，模型組小鼠血清IL-6 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，元蘑多糖高劑量組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均升高（P＜0.05，P＜0.01），中劑量組IL-6 水平升高（P＜0.01）。

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比較（±s， n＝10）

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比較（±s， n＝10）

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 元蘑菌絲發酵多糖對免疫抑制小鼠脾臟淋巴細胞增殖的影響 表3 顯示，與模型組比較，元蘑多糖各劑量組和陽性組對ConA 誘導小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力有一定促進作用（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

表3 各組小鼠脾臟淋巴細胞增殖率比較（±s， n＝10）

表3 各組小鼠脾臟淋巴細胞增殖率比較（±s， n＝10）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

3.4 元蘑菌絲發酵多糖對免疫抑制小鼠糞便氨含量的影響 表4 顯示，模型組小鼠糞便氨含量高于空白組（P＜0.05）；元蘑多糖高、中劑量組小鼠糞便氨含量低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 各組小鼠糞便氨含量比較（±s， n＝10）

表4 各組小鼠糞便氨含量比較（±s， n＝10）

注：與空白組比較，△P ＜0.05；與模型組比較，* P ＜0.05，**P＜0.01。

3.5 元蘑菌絲發酵多糖對免疫抑制小鼠小腸組織病理結構的影響 HE 染色結果如圖1 所示，空白組小鼠小腸絨毛排列整齊，上皮細胞柱形，組織結構清晰；模型組小腸組織明顯腫狀，絨毛變短萎縮甚至斷裂脫落；與模型組比較，元蘑多糖組小腸組織在形態結構上有一定的改善，絨毛長度及數量均高于模型組；另外，環磷酰胺及元蘑多糖對腸壁厚度均無明顯影響。

圖1 各組小腸組織HE 染色圖

AB-PAS 染色結果如圖2 所示，小腸組織結構形態與HE 染色結果大致相同，空白與陽性組小腸絨毛相對更完整，數量更多，排列整齊，組織結構也更清晰；與空白組比較，模型組杯狀細胞數（藍染）減少；與模型組比較，元蘑多糖組杯狀細胞數增多。

圖2 各組小腸組織AB-PAS 染色圖

4 討論

元蘑是珍貴的食藥用菌，生物活性較高，其中具有生物活性化合物主要是多糖類，多糖的生物活性范圍較廣，是生命活動所需的基本物質，主要存在于元蘑子實體及菌絲體發酵液中。據報道，食用菌多糖能提高巨噬細胞的吞噬能力，具有調節免疫能力。除多糖類化合物外還有三萜類化合物、麥角甾醇、礦物質元素、黃酮類化合物等。食藥用菌的三萜類化合物在自然界中大量存在，在純天然物質中占比較大，可以用于保肝、鎮痛、消炎、抑菌以及防治心腦血管疾病等［29］。食用菌對金屬元素有富集的能力，吳英等［30］研究發現，食用菌中含有很多對人體有益的礦物質，且富集大量的鍺和硒。食用菌黃酮類化合物具有神經保護、抗病毒、抗氧化以及抗癌等多種活性。繆錢江等［31］針對4 種食用菌進行實驗研究，發現食用菌子實體中的總黃酮含量較髙，平菇黃酮含量最髙，且抗腫瘤活性最強，能夠直接殺傷MCF7 細胞，秀珍菇抗氧化能力最強。

免疫抑制模型有3 種制備方式，一是使用免疫抑制劑致使免疫力低下，二是輻射誘導免疫低下，三是強電流刺激引起免疫低下［32］。本研究采用環磷酰胺注射誘導免疫低下模型，該模型穩定，免疫抑制效果明顯，且不會危及小鼠生命。本文就元蘑多糖的藥理活性進行了初步研究探討，發現元蘑多糖可提高免疫抑制小鼠的細胞因子水平，尤其是對IL-6 的提高更為明顯，可改善脾臟指數，促進脾臟淋巴細胞增殖，其中多糖高劑量組糞便氨含量低于模型組，對受損小鼠小腸組織形態結構具有改善作用。

綜上所述，元蘑菌絲發酵多糖可提高環磷酰胺免疫損傷小鼠的免疫功能。