基于p38MAPK、AMPK 探討華蟾毒精殺傷人肝癌細(xì)胞的機(jī)制

曹 秀，向遠(yuǎn)彩，鄧程鳳，代榮陽(yáng)，劉友平

（西南醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，四川 瀘州 646000）

原發(fā)性肝癌主要為肝細(xì)胞癌（占75%～85%），是全球第6 大最常見(jiàn)的惡性腫瘤，致死率居第4 順位，每年新發(fā)病例超過(guò)84 萬(wàn)，其中50%發(fā)生在中國(guó)［1］。肝癌目前主要的治療手段有切除移植、放化療和外科手術(shù)綜合治療。多數(shù)患者因發(fā)病隱匿，通常在晚期確診且合并肝硬化，治療選擇受到限制，預(yù)后較差［2-3］。近年來(lái)，中藥以其來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、毒副作用較低等優(yōu)點(diǎn)，被普遍用于實(shí)驗(yàn)研究和臨床。華蟾毒精是中藥蟾酥的主要活性成分之一，具有抑制腫瘤增殖和血管形成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用［4］。大量研究發(fā)現(xiàn)，華蟾毒精對(duì)肝癌［5-6］、前列腺癌［7］、結(jié)直腸癌［8］等都具有殺傷作用，但其具體的抗腫瘤機(jī)制還缺乏深入的認(rèn)識(shí)。已有研究表明，華蟾毒精可通過(guò)激活p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號(hào)通路誘導(dǎo)胃癌［9］、骨肉瘤細(xì)胞凋亡［10］，而p38MAPK 又可作為腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路的下游分子誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡［11］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用華蟾毒精處理肝癌細(xì)胞系SKHep1 和HepG2，通過(guò)檢測(cè)凋亡標(biāo)志蛋白聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］、DNA損傷標(biāo)志蛋白磷酸化的組蛋白H2AX（γ-H2AX）、pp38MAPK 及p-AMPK 等表達(dá)，以研究華蟾毒精對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用機(jī)制，為華蟾毒精治療肝癌提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑 華蟾毒精（純度98.90%，CAS 號(hào)470-37-1）購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress 公司。Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；1×OptiMEM 無(wú)血清培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；乳酸脫氫酶細(xì)胞（LDH）毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PARP、γ-H2AX、H2AX、p-p38、p38、p-AMPK、AMPK 一抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司；陰性對(duì)照（NC）-siRNA、AMPKα1-siRNA、p38MAPK-siRNA 購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2 儀器 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）；低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo 公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek 公司）；紅外發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)LI-COR 公司）；電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞SK-Hep1 和HepG2 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃加濕孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)，視具體狀態(tài)更換培養(yǎng)基。

2.2 乳酸脫氫酶（LDH）法檢測(cè)細(xì)胞毒性 取對(duì)數(shù)期肝癌細(xì)胞接種到96 孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入不同濃度華蟾毒精（5、10、25、50 nmol／L），以DMSO 為空白對(duì)照，不做任何處理為最大酶活性對(duì)照孔，每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，檢測(cè)前1 h，在最大酶活性對(duì)照孔中加入LDH 釋放液后繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1 h后將96 孔板在400×g條件下離心5 min，各孔取80 μL 上清液加入到新的96 孔板中，再向每孔中加入30 μL LDH 工作液，混勻后室溫避光孵育30 min，用酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。

2.3 siRNA 轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞接種在6 孔板中，待融合度達(dá)70%～80% 時(shí)，PBS 洗2 次，每孔加入800 μL Opti-MEM。將2.5 μLNC／ AMPKα1／p38MAPK-siRNA 與100 μL 無(wú)血清培養(yǎng)液的1×Opti-MEM 混合，同時(shí)將4 μL Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑與100 μL Opti-MEM 混合，靜置5 min，將2種溶液混合靜置15 min 后，加入到對(duì)應(yīng)的孔內(nèi)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h，更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h 后，用DMSO或50 nmol／L 華蟾毒精處理12 h，收集細(xì)胞用于Western blot 檢測(cè)。

2.4 Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞PARP、γ-H2AX、p-p38MAPK、p-AMPK 蛋白表達(dá) 取對(duì)照組（DMSO）、華蟾毒精組（5、10、25、50 nmol／L）及干擾AMPK／p38MAPK ＋華蟾毒精（50 nmol／L）組的肝癌細(xì)胞，用IP 裂解液于冰上提取細(xì)胞總蛋白，超聲破碎，4 ℃離心后，采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將蛋白樣品與上樣緩沖液充分混勻，通過(guò)SDS-PAGE 凝膠電泳、濕轉(zhuǎn)、封閉、切膜，加入一抗于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，TBST 洗滌3 次，加入二抗室溫避光孵育1 h，TBST 洗滌3 次，Odessey-CLX 掃描顯影，即得到目的蛋白的免疫印跡圖。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)GraphPad Prism 8.3.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 華蟾毒精對(duì)肝癌細(xì)胞的影響

3.1.1 華蟾毒精對(duì)肝癌細(xì)胞毒性的影響 與0 nmol／L 華蟾毒精組比較，5、10、25、50 nmol／L 華蟾毒精處理12 h后，SK-Hep1 和HepG2 細(xì)胞LDH 釋放量均增加，細(xì)胞毒性增強(qiáng)，并呈濃度依賴(lài)性，見(jiàn)圖1A～1B。隨后選用效果最為顯著的50 nmol／L 華蟾毒精處理肝癌細(xì)胞6、12 h，與對(duì)照組（DMSO）比較，50 nmol／L 華蟾毒精組SKHep1 和HepG2 細(xì)胞LDH 釋放量均增加（P＜0.05），細(xì)胞毒性增強(qiáng)，并呈時(shí)間依賴(lài)性，見(jiàn)圖1C～1D。結(jié)果表明，華蟾毒精對(duì)肝癌SK-Hep1 和HepG2 細(xì)胞具有明顯的毒性作用。

圖1 華蟾毒精對(duì)肝癌細(xì)胞毒性的影響（±s， n＝3）

3.1.2 華蟾毒精對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡和DNA 損傷的影響 與對(duì)照組（DMSO）比較，5、10、25、50 nmol／L 華蟾毒精處理肝癌細(xì)胞12 h 后，凋亡相關(guān)蛋白PARP 以及DNA 損傷標(biāo)志蛋白γ-H2AX 均呈劑量依賴(lài)性升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2A～2D；50 nmol／L 華蟾毒精處理肝癌細(xì)胞6、12 h 后，PARP及γ-H2AX 蛋白表達(dá)均呈時(shí)間依賴(lài)性升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2E～2H。結(jié)果表明，華蟾毒精可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和DNA 損傷。

圖2 華蟾毒精對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡和DNA 損傷的影響（±s， n＝3）

3.1.3 華蟾毒精對(duì)肝癌細(xì)胞p-p38MAPK、p-AMPK 蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組（DMSO）比較，5、10、25、50 nmol／L 華蟾毒精處理肝癌細(xì)胞12 h 后，細(xì)胞p-38MAPK、p-AMPK 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3A～3D；此外，50 nmol／L 華蟾毒精處理肝癌細(xì)胞6、12 h 后，p-38MAPK、p-AMPK 蛋白表達(dá)均呈時(shí)間依賴(lài)性升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3E～3H。結(jié)果表明，華蟾毒精可激活肝癌細(xì)胞p38MAPK 和AMPK 表達(dá)。

圖3 華蟾毒精對(duì)肝癌細(xì)胞p-p38MAPK、p-AMPK 蛋白表達(dá)的影響（±s， n＝3）

3.2 干擾p38MAPK 表達(dá)后華蟾毒精對(duì)肝癌細(xì)胞的影響

3.2.1 華蟾毒精通過(guò)p38MAPK 誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和DNA損傷 與siNC＋華蟾毒精組比較，sip38＋華蟾毒精組細(xì)胞PARP 和γ-H2AX 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，華蟾毒精通過(guò)激活p38MAPK 誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和DNA 損傷。

圖4 華蟾毒精通過(guò)p38MAPK 誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和DNA 損傷（±s， n＝3）

3.2.2 干擾p38MAPK 表達(dá)后對(duì)肝癌細(xì)胞中p-AMPK 表達(dá)的影響 抑制p38MAPK 基因表達(dá)后，p-AMPK 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與siNC＋華蟾毒精組比較，sip38＋華蟾毒精組p-AMPK 蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高（P＜0.05），見(jiàn)圖5。結(jié)果表明，下調(diào)p38MAPK 基因的表達(dá)可激活肝癌細(xì)胞中AMPK表達(dá)。

圖5 干擾p38MAPK 后對(duì)肝癌細(xì)胞中p-AMPK 和p38 蛋白表達(dá)的影響（±s， n＝3）

3.3 干擾AMPK 表達(dá)后對(duì)華蟾毒精誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和DNA 損傷的影響 與siNC＋華蟾毒精組比較，siAMPKα1＋華蟾毒精組肝癌細(xì)胞p-AMPK 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），PARP、γ-H2AX、p-p38MAPK 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見(jiàn)圖6A～6D；乳酸脫氫酶檢測(cè)結(jié)果顯示siAMPKα1＋華蟾毒精組LDH 水平升高（P＜0.05），見(jiàn)圖6E～6F。結(jié)果表明，敲低AMPK 能夠促進(jìn)華蟾毒精誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡和DNA損傷。

圖6 干擾AMPK 表達(dá)后對(duì)華蟾毒精誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和DNA 損傷的影響（±s， n＝3）

4 討論

原發(fā)性肝癌是全球癌癥相關(guān)發(fā)病率和死亡率高的主要原因之一，臨床上常用的治療方法均不能有效控制腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。廣譜化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)損傷機(jī)體的免疫系統(tǒng)，但與中醫(yī)藥結(jié)合可提高其治療效果［12-13］。最新肝癌治療指南也推薦了若干種現(xiàn)代中藥制劑用于手術(shù)切除后的輔助治療，可顯著緩解化療藥物的副作用，改善晚期肝癌的生存率［14］。華蟾毒精是從中華大蟾酥中提取分離出的主要活性成分，對(duì)包括肝癌、結(jié)直腸癌、多發(fā)性骨髓瘤［15］等腫瘤細(xì)胞具有明顯的殺傷作用。本研究探索了華蟾毒精對(duì)人肝癌細(xì)胞系SK-Hep1 和HepG2 的影響及其分子機(jī)制。

細(xì)胞凋亡又稱(chēng)程序性細(xì)胞死亡，主要包括線粒體途徑、死亡受體途徑及其上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如MAPK 途徑、PI3K／Akt 途徑、NF-κB 途徑等［16］。多項(xiàng)研究指出，無(wú)論是放化療藥物、細(xì)胞毒性藥物還是靶向藥，激活腫瘤促凋亡通路是治療肝癌細(xì)胞的一條有效途徑［17-18］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，華蟾毒精可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。p38MAPK 屬于MAPKs 家族，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等眾多生物學(xué)進(jìn)程，活化的p38MAPK 可以通過(guò)降低Bcl-2／Bax 比值，誘導(dǎo)線粒體功能障礙，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡［19］。本研究結(jié)果顯示，華蟾毒精上調(diào)了肝癌細(xì)胞中p-p38MAPK 蛋白表達(dá)，提示華蟾毒精殺傷肝癌細(xì)胞可能與p38MAPK 通路的激活有關(guān)。近年來(lái)，p38MAPK 作為一種腫瘤抑制因子引起廣泛的關(guān)注，如在HeLa 細(xì)胞中p38MAPK 的激活可特異性抑制腫瘤的形成［20］；在化療過(guò)程中順鉑可以激活p38MAPK 通路，達(dá)到殺傷腫瘤的作用，因此可作為順鉑的特異性治療靶點(diǎn)，具有重要臨床意義［21］。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，華蟾毒精可激活p38MAPK，而敲低p38MAPK 表達(dá)后，華蟾毒精誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡和DNA 損傷效率降低，且p-AMPK 表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，說(shuō)明在肝癌細(xì)胞中華蟾毒精可通過(guò)激活p38MAPK 發(fā)揮殺傷腫瘤的作用，且提示AMPK 也參與其中。

AMPK 作為真核細(xì)胞的能量感受器，能夠協(xié)調(diào)包括自噬、凋亡、細(xì)胞周期和蛋白質(zhì)合成在內(nèi)的一系列細(xì)胞過(guò)程，與人類(lèi)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，已成為許多代謝綜合征和腫瘤治療的重要靶點(diǎn)［22］。近年來(lái)的諸多研究發(fā)現(xiàn)，AMPK 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮雙重功能［23］，如AMPK 可作為一個(gè)腫瘤抑癌因子，負(fù)性調(diào)節(jié)癌細(xì)胞Warburg效應(yīng)從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)［24］；又可作為腫瘤的保護(hù)因子，通過(guò)直接磷酸化CREB1 促進(jìn)下游HIF1α 的轉(zhuǎn)錄激活，從而促進(jìn)葡萄糖代謝，達(dá)到加速膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)的作用［25］；也可通過(guò)調(diào)控不同的信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)腸癌［26］、乳腺癌［27］的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，華蟾毒精可上調(diào)肝癌細(xì)胞中p-AMPK蛋白表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)敲低AMPKα1 后華蟾毒精誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡和DNA 損傷程度增加，pp38MAPK 蛋白表達(dá)也升高，表明AMPK 可以保護(hù)腫瘤抵抗華蟾毒精的殺傷作用。值得注意的是本研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK 與AMPK 之間似乎存在相互調(diào)控的關(guān)系，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，在華蟾毒精殺傷人肝癌細(xì)胞SK-Hep1 和HepG2 的過(guò)程中，p38MAPK 的激活可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡和DNA 損傷，而AMPK 的激活可抑制肝癌細(xì)胞的凋亡和DNA 損傷，推測(cè)在人肝癌細(xì)胞中華蟾毒精激活p38MAPK的力度大于AMPK，最終達(dá)到殺傷腫瘤的作用。本研究不僅為華蟾毒精治療肝癌的臨床應(yīng)用提供新的理論基礎(chǔ)，也有望為華蟾毒精治療肝癌提供新的思路。