益神顆粒對環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠免疫功能及腸道菌群的影響

張艷艷孫麗麗潘綿立王松坡沈龍海*

（1.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海 200437；2.上海市生物物質(zhì)成藥性評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，上海 200437； 3.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院，上海 200437）

益神顆粒是國醫(yī)大師、滬上張氏內(nèi)科第12 代傳人張鏡人教授的經(jīng)驗方，為上海市第一人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，用于腫瘤切除術(shù)后的輔助治療。該方中靈芝具有補虛安神之功，用于一切虛勞諸疾；黃精補脾潤肺，用于脾肺不足所致納差、氣短、體倦乏力等，二者相合，靈芝益神而養(yǎng)精氣、黃精補中而安五臟，共為君藥。黃芪補氣升陽、固表內(nèi)托，為臣藥。當(dāng)歸養(yǎng)血補血、補中有行。何首烏，補肝腎益精血。以上5 味相伍，可先后天同調(diào)，氣血共補，有良好的扶正之效。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，靈芝、黃精和黃芪等均可通過影響固有免疫、特異性免疫或腸道菌群等來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)［1-4］。本研究擬通過建立環(huán)磷酰胺（CTX）誘導(dǎo)小鼠免疫異常模型，探究益神顆粒對小鼠免疫功能和腸道菌群等方面的調(diào)節(jié)作用。

1 材料

1.1 實驗動物 32 只SPF 級雄性BALB／c 小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2018-0006，動物實驗經(jīng)倫理審查通過（編號2021f097），飼養(yǎng)于上海藥理評價中心動物房內(nèi)，溫度（25±1）℃，相對濕度50%～70%，12 h／12 h 交替照明，給予顆粒飼料，自由飲水。

1.2 試劑與藥物 環(huán)磷酰胺（CTX，美國百特國際有限公司，批號9J339A）；益神顆粒（由上海市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科提供，批號20210401）。CCK-8、胰蛋白酶、紅細(xì)胞裂解液（武漢谷歌生物科技有限公司，批號FZ193503、HP203411、HJ202408）；胎牛血清（美國Gibco 公司，批號205946RP）；1640 培養(yǎng)液（以色列Biological Industries公司，批號2051244）；刀豆蛋白A（美國Simga 公司，批號P1659069）；小鼠淋巴細(xì)胞分離液（上海達科為生物技術(shù)有限公司，批號RLS2101）；FITC-CD3、APC-CD4、PECD8、PC5.5-CD4、APC-IFN-γ 抗體、Cyto-FastTMFix／Perm Buffer Set（美國Biolegend 公司，批號B303301、B295393、B311090、B318293、B335090、B335927）。

1.3 儀器 電子天平（德國賽多利斯公司，型號ALC-210.3）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號SWCJ-2FD）；二氧化碳培養(yǎng)箱、冷凍離心機、全波長多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司，型號371、Micro2R、Varioskan Flash）；低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，型號TDZ5-WS）；流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter 公司，型號CytoFLEX）；細(xì)胞計數(shù)儀（美國DeNovix 公司，型號Celldrop I）。

2 方法

2.1 造模及給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，按體質(zhì)量隨機分為正常組、模型組和益神顆粒低、高劑量組，每組8 只，益神顆粒低、高劑量組灌胃給予2.5、5.0 g／kg 益神顆粒，正常組和模型組灌胃給予等量生理鹽水，連續(xù)15 d，于給藥后第8～10 天，模型組和益神顆粒組小鼠腹腔注射80 mg／kg CTX進行造模，實驗結(jié)束后對各項指標(biāo)進行檢測。

2.2 體質(zhì)量和臟器指數(shù)檢測 給藥期間，各組小鼠每3 d測定1 次體質(zhì)量，繪制體質(zhì)量變化曲線。給藥結(jié)束后，斷頸處死各組小鼠，分離脾臟和胸腺并稱定質(zhì)量，計算臟器指數(shù)。

2.3 外周血白細(xì)胞和骨髓有核細(xì)胞計數(shù) 給藥結(jié)束后，各組小鼠眼眶取血，肝素鈉抗凝，利用全自動血液分析儀進行外周血白細(xì)胞（WBC）計數(shù)。同時，各組小鼠取右側(cè)股骨，用10 mL 3%醋酸液沖洗骨髓內(nèi)細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)骨髓有核細(xì)胞（BMNC）。

2.4 脾淋巴細(xì)胞增殖檢測 無菌條件下取出小鼠脾臟，置于生理鹽水培養(yǎng)皿中，剪碎后過200 目尼龍篩網(wǎng)，收集脾細(xì)胞懸液，1 000 r／min 離心，棄上清獲得細(xì)胞沉淀，按照1∶5 的比例加入紅細(xì)胞裂解液，吹打均勻，冰上靜置5 min，1 000 r／min 離心后棄上清，用含10% 胎牛血清的1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，收集懸浮細(xì)胞，離心后重懸制備密度為5×106／mL 的淋巴細(xì)胞懸液，取200 μL 淋巴細(xì)胞懸液，加入1 μL 刀豆蛋白A（ConA，終質(zhì)量濃度為5 μg／mL），混合后加入到96 孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入10 μL CCK-8 試劑，2 h 后用酶標(biāo)儀于450 nm 波長處測定光密度（OD）值，以O(shè)D值表示增殖能力。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測脾臟T 淋巴細(xì)胞亞群

2.5.1 CD3＋T、CD4＋T、CD8＋T 細(xì)胞亞群檢測 將“2.4”項下制備的脾淋巴細(xì)胞制成密度為1×107／mL 的細(xì)胞懸液，取100 μL 單細(xì)胞懸液，分別加入CD3、CD4、CD8a 抗體，混勻后于冰上避光孵育20 min，加入1 mL Cell Staining Buffer 洗滌2 次，100 μL Cell Staining Buffer 重懸后上機檢測。另設(shè)4 個對照組，分別為空白對照（不加抗體）、CD3對照（只加CD3 抗體）、CD4 對照（只加CD4 抗體）、CD8對照（只加CD8a 抗體），其余操作步驟同上。

2.5.2 Th1 細(xì)胞亞群檢測 將“2.4” 項下制備的脾淋巴細(xì)胞制成密度為1×106／mL 的細(xì)胞懸液，加入適量的Cell Activation Cocktail（含Brefeldin A）刺激6 h，收集細(xì)胞懸液，離心，重懸后調(diào)整細(xì)胞密度為1×107／mL，取100 μL單細(xì)胞懸液，加入CD4 抗體，混勻后于冰上避光孵育20 min，加入1 mL Cell Staining Buffer 洗滌2 次，加入150 μL Cyto-FastTMFix／Perm Buffer，混勻后室溫孵育20 min，1 mL Cyto-FastTMPerm Wash solution 洗滌2 次，加入IFN-γ 抗體，混勻后室溫孵育20 min，加入1 mL Cell Staining Buffer 洗滌2 次，200 μL Cell Staining Buffer 重懸，上機檢測。另設(shè)3個對照組，分別為空白對照（不加抗體）、CD4 對照組（只加CD4 抗體）和IFN-γ 對照組（只加IFN-γ），其余操作步驟同上。

2.6 外周血T 淋巴細(xì)胞亞群檢測 眼眶采血獲得小鼠新鮮外周血，肝素鈉抗凝，用無菌PBS 稀釋1 倍，向15 mL 離心管中加入3 mL 小鼠淋巴細(xì)胞分離液，將稀釋后的血液平鋪在淋巴細(xì)胞分離液上層（緩慢加入，避免破壞兩液體的分界面），800×g離心20 min，取白膜層即得外周血淋巴細(xì)胞，重懸計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107／mL，后續(xù)步驟同“2.5.1” 項。

2.7 腸道菌群多樣性分析 給藥結(jié)束后，每組各選取5 只小鼠取新鮮糞便，樣品置于無菌EP 管中，－80 ℃保存。所有樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序工作，隨后在美吉生物在線云平臺上進行數(shù)據(jù)處理與分析，比對數(shù)據(jù)庫為Silva（Release138 http：／ ／www.arb-silva.de），α多樣性指數(shù)組間差異檢驗采用Wilcoxon rank-sum test，物種差異分析采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 益神顆粒對免疫抑制小鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)的影響如圖1 所示，給藥期間，正常組小鼠體質(zhì)量保持穩(wěn)定增長，活動度良好；模型組小鼠注射CTX 后體質(zhì)量下降，毛色暗淡，活動度降低；與模型組比較，益神顆粒各劑量組小鼠體質(zhì)量下降減緩，說明益神顆粒能夠恢復(fù)小鼠體質(zhì)量，改善小鼠活動度，提高生存質(zhì)量。如圖2 所示，與正常組比較，模型組小鼠脾臟和胸腺指數(shù)降低（P＜0.01），說明模型復(fù)制成功；與模型組比較，益神顆粒各劑量組小鼠的脾臟指數(shù)升高（P＜0.01），說明益神顆粒對CTX 造成的臟器損傷有改善作用。

圖2 各組小鼠臟器指數(shù)變化（±s， n＝8）

3.2 益神顆粒對免疫抑制小鼠WBC 和BMNC 計數(shù)的影響 如表1 所示，與正常組比較，模型組小鼠WBC 和BMNC 數(shù)量減少（P＜0.01）；與模型組比較，益神顆粒各劑量組小鼠WBC 和BMNC 數(shù)量增加（P＜0.01），說明益神顆粒能夠減輕CTX 對骨髓的破壞，增加WBC 和BMNC 數(shù)量。

表1 各組小鼠WBC 和BMNC 計數(shù)比較（±s， n＝8）

表1 各組小鼠WBC 和BMNC 計數(shù)比較（±s， n＝8）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.3 益神顆粒對免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 如表2 所示，與正常組比較，模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力降低（P＜0.01）；與模型組比較，益神顆粒各劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力增加（P＜0.05），說明益神顆粒可提高淋巴細(xì)胞增殖能力。

表2 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力比較（±s， n＝8）

表2 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力比較（±s， n＝8）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05。

3.4 益神顆粒對免疫抑制小鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞亞群的影響 如圖3A 所示，與正常組比較，模型組CD3＋T、CD4＋T細(xì)胞亞群比例和CD4＋／CD8＋比值上升（P＜0.01），CD8＋T細(xì)胞亞群比例降低（P＜0.01）；與模型組比較，益神顆粒各劑量組CD3＋T、CD4＋T 細(xì)胞亞群比例和CD4＋／CD8＋比值降低（P＜0.01），CD8＋T 細(xì)胞亞群比例上升（P＜0.01）。對脾臟Th1 細(xì)胞亞群分析，結(jié)果如圖3B 所示，與正常組比較，模型組Th1 比例上升（P＜0.01）；與模型組比較，益神顆粒各劑量組Th1 比例下降（P＜0.01），典型流式圖見圖3C。

圖3 各組小鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞亞群變化（±s， n＝8）

3.5 益神顆粒對免疫抑制小鼠外周血T 淋巴細(xì)胞亞群的影響 如圖4A 所示，與正常組比較，模型組CD3＋T、CD4＋T細(xì)胞亞群比例和CD4＋／CD8＋比值上升（P＜0.01），CD8＋T細(xì)胞亞群比例降低（P＜0.01）；與模型組比較，益神顆粒高劑量組CD3＋T、CD4＋T 細(xì)胞亞群比例和CD4＋／CD8＋比值降低（P＜0.01），CD8＋T 細(xì)胞亞群比例上升（P＜0.01），典型流式圖見圖4B。

圖4 各組小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群變化（±s， n＝8）

3.6 益神顆粒對免疫抑制小鼠腸道菌群的影響

3.6.1 多樣性分析 α 多樣性指數(shù)可評估腸道菌群的多樣性和豐富度，本研究以Shannon 和Ace 指數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，進行差異分析。如圖5A～5B 所示，各組之間Shannon 和Ace 指數(shù)無明顯變化（P＞0.05），提示短期使用CTX 對小鼠腸道菌群的多樣性和豐度無影響。β 多樣性利用各樣本序列間的進化關(guān)系及豐度信息來計算樣本間距離，反映樣本（組）間是否具有顯著的微生物群落差異。如圖5C 所示，模型組腸道菌群與正常組存在差異（P＞0.05），說明CTX 可引起小鼠腸道菌群物種組成發(fā)生變化；益神顆粒低劑量干預(yù)后，免疫抑制小鼠腸道菌群趨向正常組。

圖5 腸道菌群多樣性分析（±s， n＝5）

3.6.2 物種組成分析 如圖6A 所示，門水平上Bacteroidota和Firmicutes是小鼠腸道菌群的主要組成部分，占菌群總數(shù)的90% 以 上，其次是Campilobacterota和Patescibacteria等。采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗分析組間物種組成差異，結(jié)果見圖6B，將相對豐度排名前4 的細(xì)菌展開分析，如圖6C～6F 所示，與正常組比較，模型組Bacteroidota相對豐度降低（P＜0.05）；與模型組比較，益神顆粒各劑量組Bacteroidota相對豐度增加（P＜0.05，P＜0.01）。Firmicutes／Bacteroidota（F／B）比值被用來評估腸道菌群的平衡，CTX 使得F／B 值增大，引起腸道菌群異常，而益神顆粒可在一定程度上逆轉(zhuǎn)該趨勢。

圖6 門水平上的物種組成和差異分析（±s， n＝5）

如圖7A 所示，在屬水平上norank＿f＿Muribaculaceae和Lactobacillus為優(yōu)勢菌屬，在正常小鼠腸道菌群中占50%以上。采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗分析組間物種組成差異，結(jié)果見圖7B，將相對豐度排名前4 的菌屬展開分析，如圖7C～7F 所 示，與正常組比較，模型組norank＿f＿Muribaculaceae和Lactobacillus相對豐度降低（P＜0.01），Lachnospiraceae＿NK4A136＿group相對豐度升高（P＜0.05）；與模型組比較，益神顆粒各劑量組norank＿f＿Muribaculaceae相對豐度升高（P＜0.05，P＜0.01），低劑量組Lactobacillus相對豐度升高（P＜0.01）。

圖7 屬水平上的物種組成和差異分析（±s， n＝5）

4 討論

本研究從臟器指數(shù)、T 細(xì)胞亞群和腸道菌群3 個方面探究益神顆粒的藥效作用。CTX 作為烷基化抗癌藥物，殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也會損傷宿主的免疫器官和免疫細(xì)胞［5-7］。本研究表明，益神顆粒在一定程度上保護免疫器官，增加WBC 和BMNC 數(shù)目，提高淋巴細(xì)胞增殖能力。T細(xì)胞亞群分析結(jié)果顯示，CTX 處理后，小鼠體內(nèi)CD3＋T、CD4＋T、CD8＋T 以及Th1 比例上升，與文獻報道基本一致［8-10］；益神顆粒干預(yù)后，上述指標(biāo)向正常組偏移，說明益神顆粒能在一定程度上調(diào)節(jié)CTX 導(dǎo)致的T 細(xì)胞亞群比例失調(diào)。其中Th1 比例升高可能與以下2 點有關(guān)，一是CTX破環(huán)免疫抑制性T 細(xì)胞［8，11］，促進Th1 的分化；二是CTX破壞腸道內(nèi)環(huán)境平衡，導(dǎo)致黏膜通透性增加，細(xì)菌或其成分（LPS）易位［12］。

益神顆粒作為由靈芝、黃芪、黃精、當(dāng)歸和何首烏組成的中藥復(fù)方制劑，富含多糖成分。植物多糖作為腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，具有調(diào)節(jié)腸道菌群比例，促進腸黏膜修復(fù)，增強腸黏膜分泌型免疫球蛋白表達及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平等作用［10，13-15］。采用16S rRNA 測序技術(shù)，對小鼠的腸道菌群進行分析，結(jié)果顯示，益神顆粒能夠在一定程度上恢復(fù)CTX 造成的菌群組成失調(diào)。門水平上，益神顆粒能夠恢復(fù)優(yōu)勢菌群Bacteroidota相對豐度，Bacteroidota作為有益菌［15］，能夠促進腸道淋巴組織的發(fā)育，其代謝產(chǎn)物對激活T 細(xì)胞依賴的免疫反應(yīng)至關(guān)重要［16］。屬水平上，益神顆粒部分恢復(fù)了norank＿f＿Muribaculaceae和Lactobacillus菌屬比例，norank＿f＿Muribaculaceae為新確立的菌屬名，屬于Bacteroidota，其具體功能尚無深入研究［17］；Lactobacillus也是有益菌［18］，能夠通過固有免疫和適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)宿主免疫，與腸道健康密切相關(guān)［19-20］。此外，腸道菌群與消化吸收有關(guān)，能夠為宿主提供能量，益神顆粒對腸道菌群的正向調(diào)節(jié)作用在增強宿主營養(yǎng)攝入方面也有重要作用。

綜上所述，益神顆粒能夠改善CTX 誘導(dǎo)的小鼠免疫功能異常，恢復(fù)T 細(xì)胞水平。另外，益神顆粒能夠調(diào)節(jié)腸道菌群，使CTX 處理后的小鼠菌群趨于正常，這對于小鼠免疫水平和營養(yǎng)吸收都有重要作用。本研究尚未對腸道菌群與宿主免疫水平的具體相關(guān)性進行研究，僅初步摸索了益神顆粒在T 細(xì)胞和腸道菌群等方面的調(diào)節(jié)作用，還需進行更深一步的研究。