基于UPLC-MS 法及網絡藥理學預測紫紅參質量標志物

林 源，朱雪艷，黃豆豆，黃寶康，王宏瑞，卜其濤*，張成中*

（1.溫嶺市中醫院，浙江 溫嶺 317500； 2.中國人民解放軍海軍軍醫大學藥學系，上海 200433； 3.上海中醫藥大學中藥研究所，上海 201203）

人參Panax ginsengC.A.Meyer 是傳統的名貴補益中藥，始載于《神農本草經》，其炮制方法及炮制工藝眾多，形成生曬參、紅參、糖參等。紫紅參又稱黑參，其制備工藝主要有生物發酵法和多次蒸曬法［1-2］，在加工炮制過程中，其有效成分人參皂苷等發生水解、脫羧、異構化等［3］變化。經測定，生人參中含量較高的人參皂苷Rb1、Rg1、Re 等在紫紅參中無法檢出或含量降低［4］，稀有皂苷如人參皂苷Rg3、Rg5、Rg6 等含量升高［5-7］。研究發現，紫紅參相比生曬參、紅參具有更好的降血糖［8］、降血脂［9］、減肥［10］、抗癌［11］、保肝［12］、抗病毒［13］等作用。中藥炮制“生熟異用”，紫紅參與生曬參、紅參在化學成分及藥理作用上具有差異，其質量控制、藥理作用也應有別于紅參等。目前，紫紅參的炮制工藝尚無統一標準，質量控制、活性成分、藥理作用等方面尚有較大的研究空間［14］。劉昌孝院士提出中藥質量標志物（Q-marker）的新概念［15］，中藥Qmarker 從生源途徑、化學物質基礎、炮制加工過程、藥效研究、中醫理論等層面，將中藥物質基礎、有效性、質量控制密切關聯。本實驗采用UPLC-Q／TOF-MS 法測定紫紅參及其原料藥人參之間的化合物差異，通過多元統計分析解析炮制對人參皂苷種類的影響，鑒定紫紅參中差異性稀有皂苷，基于網絡藥理學［16］與分子對接［17］技術對所鑒定的差異化合物進行驗證，研究紫紅參差異化合物的藥理活性及其作用機制，預測紫紅參潛在Q-marker，以期為紫紅參后續研究奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 1290 UPLC 型液相色譜儀串聯6530 Q／TOF 型高分辨質譜（美國安捷倫公司）；SK7200H 型超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）；RH-600A 型高速多功能粉碎機（江蘇榮潔醫療科技有限公司）；XS105DU 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Centrifuge5810R 型高速臺式冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；電蒸鍋（浙江蘇泊爾股份有限公司）；鼓風式干燥箱（上海般諾生物科技有限公司）。

1.2 試劑與藥物 人參購于亳州市藥材市場，經海軍軍醫大學生藥學教研室黃寶康教授鑒定為正品。乙腈、甲醇為色譜純，購自德國Merck 公司；甲酸為色譜純，購自美國Thermo Fisher 公司；水為蒸餾水，購自廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

2 方法

2.1 紫紅參炮制前后成分差異分析

2.1.1 UPLC-MS 條件

2.1.1.1 色譜 Acquity UPLCBEH-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相0.1%甲酸（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，5%～23% B；5～9 min，23%～30% B；9～13 min，30% B；13～13.55 min，30%～35%B；13.5～17 min，35%B；17～17.5 min，35%～39%B；17.5～20 min，39% B；20～26 min，39%～95% B）；柱溫35 ℃；體積流量0.3 mL／min；進樣量2 μL。

2.1.1.2 質譜 電噴霧離子源（ESI），正、負離子模式掃描；毛細管電壓4 000 V（正離子模式）、3 500 V（負離子模式）；錐孔電壓65 V；脫溶劑氣體氮氣；氣體體積流量11 L／min；脫溶劑溫度350 ℃；離子源溫度150 ℃；掃描范圍m／z100～1 700；掃描時間3.00 spectra／s；碰撞能量30 eV；碰撞氣體氮氣；掃描方式allionfragment 模式。質譜數據采集及處理軟件Masshunter 工作站。

2.1.2 供試品制備 取人參6 批，各分成2 份，1 份凈制，另1 份經九蒸九曬制成紫紅參。各取人參、紫紅參粉碎，過三號篩，精密稱取粉末50 mg，置于5 mL EP 管中，加入2 mL 80%甲醇，常溫下超聲處理（50 kHz，760 W）30 min，放冷，14 000 r／min 離心15 min，取上清液，即得。

2.1.3 多元統計分析 查閱并整理歸納國內外文獻關于人參化學成分的信息，包括名稱、分子式、結構式，并將所有信息導入Masshunter 軟件中，創建人參專屬數據庫。將allionfragment 模式下采集的原始質譜數據導入Masshunter軟件中，用所建立的分析方法對人參化學成分進行自動識別，得到初步的化合物鑒定結果，進一步運用Masshunter軟件對正離子與負離子模式下的總離子流（TIC）進行處理，結合目標化合物特征離子的精確質量數、相對保留時間、分子式、對照品信息以及相關報道的文獻，進行人工識別并確定。

將采集的原始質譜數據進行格式轉化（RAW 格式轉化成ABF 格式），MS-DIAL 軟件可以基于轉化后的ABF 格式進行數據的預處理，參數設置為保留時間0.5～25 min；掃描范圍m／z100～1 700；MS1 質量誤差0.01 Da；MS2 質量誤差0.02 Da；最低峰高5 000。采用SIMCA-p14.1 軟件對數據進行多元變量統計分析。將MS-DIAL 軟件處理后得到的歸一化數據，以Excel 格式導入SIMCA-p14.1 軟件中，依次進行主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）；根據兩組之間t檢驗得出的P值（P＜0.05）進行差異化合物篩選。

2.2 質量標志物作用靶標及網絡藥理學預測 根據UPLCMS 分析結果選擇紫紅參中特有而人參中不具有的化合物，再通過PubChem 數據庫查詢相關化合物Canonical SMILES編號，輸入Swiss Target Prediction 數據庫（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch／）獲取化合物所對應的靶標蛋白的Uniprot ID。再將其導入在線STRING 11.0 數據庫軟件（https：／ ／string-db.org／cgi／input.pl）進行PPI 網絡分析。利用Metascape 數據庫（https：／ ／metascape.org／gp／index.html）對潛在的靶點進行基因本體（GO）功能和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。最后通過Cytoscape 3.8.2軟件，篩選核心靶標，并構建“成分-靶標-通路” 網絡關系綜合分析結果。

2.3 差異成分-靶標分子對接 通過PubChem 數據庫選取人參皂苷Rg3、Rg5、Rh3、Rk1、compound K 等成分化合物結構，選取“成分-靶點-通路” 網絡中自由度前3 的靶標為對接靶標，檢索PDB 數據庫（http：／ ／www.rcsb.org／）獲得靶標的蛋白結構，將上述蛋白與化合物結構文件導入pymol 軟件進行去水、加氫、刪除重復鏈等預處理，最后模擬靶標和作用的化學成分結合模式，計算結合能，結合能小于0 表明可以自由結合［17］。

3 結果

3.1 基于UPLC-MS 的紫紅參特有成分分析

3.1.1 多元統計分析炮制對成分的影響 取“2.1.2” 項下人參及其炮制品紫紅參供試品溶液，在“2.1.1” 項條件下進樣測定，得到正、負離子模式下人參及其炮制品紫紅參代表性樣品總離子流圖（圖1）。結果顯示，紫紅參相對于其原藥材人參，成分變化較明顯，在長時間段出現新的化合物峰。進一步比較人參生品與紫紅參炮制品之間的區別，通過無監督PCA 分析和有監督PLS-DA 分析，得分散點圖見圖2，結果顯示，生品、炮制品能得到較好的分離趨勢，說明人參經九蒸九曬制成紫紅參后其化學成分發生顯著變化。

圖1 人參、紫紅參UPLC-MS 檢測總離子流圖（TIC）

圖2 炮制前后人參藥材的PCA 得分圖

3.1.2 紫紅參差異化合物鑒定 共鑒定10 個差異性化合物，包括稀有皂苷人參皂苷Rg5、人參皂苷Rk1、compound K、人參皂苷Rh3 等，見表1。

表1 紫紅參差異性化合物鑒定

3.2 基于網絡藥理學的紫紅參質量標準物預測

3.2.1 紫紅參潛在質量標志物作用靶標篩選 根據

“3.1.2” 項下化合物鑒定結果，結合紫紅參中英文文獻研究，選擇紫紅參中含有而其原料藥人參中所不具有或含量甚微的化合物人參皂苷Ra1、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rg5、人參皂苷Rk1、姜狀三七苷R1、compound K、人參皂苷Rh3、人參皂苷Rs5［7］等，獲取其所對應的靶標蛋白的Uniprot ID，去除重復，共得到158 個潛在靶點。“紫紅參-成分-潛在靶點” 可視化網絡圖見圖3，網絡中包括167個節點和262 條邊，平均節點度值3.138。節點的度值代表與該節點相連的邊的數量，節點的度值越大，該節點在圖中的大小也就越大，顏色也越深。

圖3 基于潛在質量標志物構建的“紫紅參-成分-靶點” 網絡圖

3.2.2 化合物蛋白-蛋白相互作用網絡構建 將8 個化合物篩選出的158 個靶點進行PPI 網絡分析，選擇物種為“Homo sapiens”，蛋白交互參數評分值為“high confidence＞0.9”，隱藏網絡中無聯系的節點，其余參數設置不變，獲得化合物靶點PPI 網絡圖（圖4），共獲得91 個節點，347條邊，平均節點度為7.63，預期邊數117，PPI 富集P值＜1.0×10－16。再對PPI 網絡進行拓撲屬性分析，計算選取間隔度、親密度、自由度值3 個重要拓撲參數，共篩選24 個網絡參數大于均值（218.8、0.003、7.93）的核心靶標（圖5），包括原癌基因（JUN）、信號傳導與轉錄激活因子3（STAT3）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、表皮生長因子R（EGFR）、基質金屬蛋白酶2（MMP2）、絲裂原活化蛋白激酶1、3、8（MAPK1、MAPK3、MAPK8）等。

圖5 核心靶點篩選

3.2.3 GO 功能和KEGG 通路富集分析 根據錯誤發現率（FDR）＜0.05，共篩選出2 973 條GO 本體條目，其中靶點經生物過程相關條目2 464 條，主要涉及轉移酶活性的正調控、蛋白質磷酸化的正調控、細胞對有機氮化合物的反應等；細胞組分有233 個條目，主要涉及膜筏、膜微區、細胞-基底連接等；分子功能有276 個條目，主要涉及蛋白質絲氨酸／蘇氨酸／酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、磷酸轉移酶活性、激酶活性等，各選取顯著性前10 條目展示，見圖6。KEGG 通路富集分析得到247 個條目，結果僅顯示顯著性前20 的條目，主要涉及癌癥通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、癌癥中的PD-L1 表達和PD-1 檢查點通路、催乳素信號通路、ErbB 信號通路、胰腺癌、乳腺癌、乙肝等，見圖7。

圖6 GO 富集分析

圖7 KEGG 富集分析

3.2.4 構建“紫紅參-成分-靶標-通路” 關聯網絡 根據篩選所得紫紅參中8 個潛在質量標志物作用與疾病相關的24個關鍵靶標及20 個關鍵通路見表2，“紫紅參-成分-靶標-通路” 的關聯網絡圖見圖8，其中包括53 個節點和472 邊，平均節點度值17.8。節點的度值代表與該節點相連的邊的數量，節點的度值值越大，該節點在圖中的大小也就越大，顏色也越深。由圖 8 可知，STAT3、Akt1、MAPK1、MAPK3、EGFR、HRAS、PIK3CA 等靶點的連接度較高，可能是紫紅參發揮作用的關鍵靶點；癌癥通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、癌癥中的PD-L1 表達和PD-1檢查點通路、催乳素信號通路、ErbB 信號通路等20 條信號通路可能是紫紅參發揮藥理活性的關鍵信號通路。

圖8 “紫紅參-成分-核心靶點-通路” 網絡圖

表2 紫紅參網絡預測關鍵信號通路

3.3 成分-靶標的分子對接 選擇度值排名前3 的核心靶點（STAT3、PTAFR、FGF1）與主要差異性化合物進行分子對接，以厄達替尼Erdafitinib 為陽性對照藥，選取最低結合能組合，見表3。結果表明，人參皂苷Rg3、Rg5、Rh3 等與3個靶蛋白具有較強的結合能力，見圖9，其中結合能越小，則結構穩定性越強，對接的活性越好。

圖9 差異成分-關鍵靶標分子對接可視化

表3 成分-靶標分子對接結果

4 討論與結論

經UPLC-Q／TOF-MS 檢測及多元統計分析解析發現，紫紅參中人參皂苷Ra1、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rg5、人參皂苷Rk1、姜狀三七苷R1、compound K、人參皂苷Rh3 等為其原料藥人參中所不具有或含量甚微的稀有皂苷類成分。人參經反復蒸曬，人參皂苷發生水解、脫羧、異構化等復雜的化學變化后，轉化或產生新的人參皂苷，如Rg3、Rg5、Rs4、Rs5、Rh2、Rh3、Rk1、Rk3、CK、F1 等［7，18］，其中人參皂苷Rg3［19］、Rg5［20］、Rk1［21］、Rh2［22］、Rh3［23］、CK［24］等具有顯著藥理活性。結合網絡藥理學及分子對接技術預測紫紅參潛在的Q-Marker，將中藥Q-Marker 的研究思路與紫紅參的炮制相結合，闡明炮制過程中化學成分的變化及其對炮制前后藥理活性差異的影響，揭示紫紅參炮制對Q-Marker 的影響，探尋紫紅參潛在的Q-Marker［25］。

本實驗在UPLC-MS 鑒定的基礎上選擇差異性化合物人參皂苷Rg3、Rg5、Rh3 等，分別構建“紫紅參-成分-靶點”及“紫紅參-成分-核心靶點-通路” 關系網，經GO、KFGG富集分析，發現紫紅參可通過調控相關靶點，包括STAT1、VEGF、EGFR、MAPK1、磷脂酰肌醇-3-激酶亞基（PIK3CA）、蛋白激酶（Akt1）、雷帕霉素機械靶蛋白（MTOR）等24 個核心靶點，作用于癌癥通路、內分泌抵抗糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、催乳素信號通路等。

有研究發現，人參皂苷Rg3 可能通過抑制PI3K-Akt 信號通路，調控其下游相關增殖和凋亡蛋白的表達，抑制宮頸癌HeLa 細胞增殖并促進其凋亡［26］。人參皂苷Rh2 可以通過競爭性結合EGFR 而阻止受體磷酸化，從而抑制PI3KAkt-mTOR 信號通路，并最終抑制膠質細胞瘤生長［27］。人參皂苷Rg5 可通過抑制Akt 信號通路的活化，抑制癌細胞增殖、侵襲、遷移并誘導細胞周期阻滯和凋亡，進而發揮抗腫瘤作用［28-29］。同樣，人參皂苷Rk1 能夠通過抑制ROSPI3K-Akt 信號通路誘導乳腺癌細胞死亡［30］；人參皂苷CK的抗癌及降糖作用也與PI3K-Akt 信號通路有關［24］。本研究表明，紫紅參中差異性人參皂苷Rg3、Rg5、Rk1、Ck 等對Akt、EGFR、PI3K、mTOR、STAT 等蛋白產生作用，通過PI3K-Akt-mTOR 信號通路、癌癥通路等表現出抗乳腺癌、結腸癌、胰腺癌、肝癌等藥理活性，與本實驗中網絡藥理學及分子對接的預測相符合，人參皂苷Rg3、Rg5 等具有紫紅參潛在質量標志物的特性。

本研究所篩選差異性化合物可以作為紫紅參潛在的QMarker，可為紫紅參后續藥理作用及質量控制研究提供基礎，有助于提高人參炮制產業的發展。