滅瘢膏減少瘢痕形成的作用及其機制研究

王浩南，吳雨蒙，張 喆，梁夢夢，劉 謙，，張永清*

（1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355； 2.山東沃華醫藥科技股份有限公司博士后流動站，山東濰坊 261000）

丹參屬于大宗常用中藥材，為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根與根莖［1］，首載于《神農本草經》。現代研究發現，丹參含有丹參酮類、丹酚酸類等活性成分，具有抑菌［2］、抗炎［3］、抑制新生血管［4-5］、抗血栓、抗心肌缺血再灌注損傷、抗癌等藥理作用［6-9］。皮膚創傷在臨床上極為常見，后期愈合過程中極易形成瘢痕，影響美觀，導致患者產生“揮之不去的陰影，難以言表的憂傷”，關節處瘢痕組織甚至會喪失部分功能，嚴重影響生活質量。皮膚創傷愈合分為止血、炎癥、愈合、重塑4 個時期［10-11］。研究顯示，丹參及其制劑具有加快創面愈合、降低感染率、減輕水腫、減少瘢痕形成等作用［12-13］。課題組發掘了一個以丹參為主要原料用于消除皮膚創傷瘢痕的民間驗方，并在工藝研究的基礎上研制成滅瘢膏。本研究對滅瘢膏的活性成分進行了檢測，并通過動物與細胞實驗對其減少瘢痕殘留的作用及機制進行研究，旨在為新產品研制和丹參資源充分利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695 高效液相色譜（美國Waters 公司）；Spectra Max M2 酶標儀［美谷分子儀器（上海）有限公司］；Scientz-24 高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；IX71 生物倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 試劑與藥物 丹參飲片原植物由山東中醫藥大學藥用植物園種植，2019 年11 月采收后去除泥土，切片，曬干，經山東中醫藥大學張永清教授鑒定為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.。蒸餾水、超純水（實驗室自制）；0.9%生理鹽水（辰欣藥業股份有限公司）；甲醇、乙醇（天津富宇精細化工有限公司）。羊脂（泰安明睿建設工程有限公司）；白凡士林（南昌白云藥業有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，國藥集團化學試劑有限公司）；丹參素、二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮ⅡA對照品（上海源葉生物科技有限公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、I 型膠原蛋白（Col1）、轉化生長因子β1（TGF-β1）抗體（英國 Abcam 公司）；TGF-β3抗體（美國ImmunoWay 公司）；總蛋白（BCA 法）測定試劑盒、VEGF-A、EGF ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；人源VEGF、EGF ELISA 試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司）。

2 方法

2.1 藥物制備

2.1.1 羊脂 取純凈羊脂置于鍋中，2 000 W 加熱23 min，放涼后4 ℃保存備用。

2.1.2 滅瘢膏 取羊脂400 g 置于鍋中，2 000 W 加熱20 min，丹參飲片160 g 用蒸餾水濕潤攪拌均勻后加入進行煎炸（1 600 W，3 min），炸至丹參飲片外圈發黑、體積縮小，中心發黃后停止加熱，過濾，去渣，羊脂部分放冷4 ℃保存備用。

2.1.3 丹參酮軟膏 按照110 mg 隱丹參酮、105 mg 丹參酮ⅡA與50 g 白凡士林60 ℃混勻，冷卻，4 ℃冷藏備用。

2.2 滅瘢膏活性成分提取與含量測定 取1 g 滅瘢膏分別用20 倍量蒸餾水、80% 乙醇，40 ℃超聲提取2 h，放冷，溶劑與油層分離后收集溶劑層，通風櫥放置揮干，加20 mL甲醇溶解，0.22 μm 微孔濾膜過濾，－20 ℃冷藏備用供HPLC 分析。

色譜條件為ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 nm×250 nm，5 μm）；流動相0.01% 磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；丹酚酸類檢測波長286 nm，丹參酮類檢測波長270 nm。

2.3 動物實驗

2.3.1 實驗動物 SPF 級SD 雄性大鼠，4 周齡，體質量（180±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2019-0008，SPF 環境單只單籠飼養，適應性飼養7 d 后開始實驗。

2.3.2 分組、造模及給藥 60 只大鼠隨機分為對照組、丹參酮軟膏組、滅瘢膏組、羊脂組，每組15 只，用乙醚麻醉，剃凈背部毛發，手術剪裁去背部脊椎兩側對稱的2 個1.0 cm×1.0 cm 面積皮膚，深入皮下，消毒，即造模完成，造模與取材位置見圖1 缺口部分。對照組只用繃帶包扎；羊脂組、滅瘢膏組、丹參酮軟膏組涂抹相應藥物后繃帶包扎，造模第1 天開始給藥，每天1 次，每次1 g。

圖1 大鼠造模及取材位置示意圖

2.3.3 創傷愈合率測定 采用透明膜描記稱重法測定傷口面積，給藥第0、3、7、11、15 天，用透明膜描記創面大小，以此為模板，將質地均勻的硬紙片剪成同樣大小，稱定硬紙片質量，硬紙片質量表示創面面積大小，計算創傷愈合率，公式為創傷愈合率＝（第0 天創傷面積－第N 天創傷面積）／第0 天創傷面積×100%。

2.3.4 樣品處理與總蛋白、生長因子測定 給藥7 d 后選取7 只大鼠，處死取左右兩側愈傷組織（均為大鼠背部兩側造模位置的愈傷組織）標記為A 組，經液氮速凍后于－80 ℃保存；給藥15 后處死剩余8 只大鼠，取左右兩側愈傷組織標記為B 組，經液氮速凍后于－80 ℃保存。B 組左側愈傷組織進行Masson、天狼猩紅染色，使用Image J 軟件（IHC Tool Box 插件）計算膠原纖維染色面積比例；取A、B 兩組右側愈傷組織（0.1±0.01）g，加生理鹽水制成10%組織勻漿液，4 ℃、6 000 r／min 離心10 min，取上清液用蛋白定量測定試劑盒、VEGF-A 及EGF ELISA 試劑盒測定總蛋白及EGF、VEGF-A 水平，其中各生長因子水平＝各生長因子含量／各樣品總蛋白水平。

2.4 細胞實驗

2.4.1 細胞來源及培養 人皮膚成纖維細胞（HFF-1）、人臍靜脈內皮細胞（EA.hy926）購自中國科學院細胞庫；人永生化角質形成細胞（HaCaT）購自北京北納創聯生物技術研究院。EA.hy926、HaCaT 細胞使用含10% 胎牛血清、100 U／mL 雙抗的DMEM 培養基；HFF-1 細胞使用HFF-1 完全培養液，于5% CO2、37 ℃、相對飽和濕度95%條件下松蓋培養，每天換液1 次，細胞長至80%時消化傳代，取第3～8 代后對數期細胞用于實驗。

2.4.2 MTT 法檢測細胞增殖活性 EA.hy926、HaCaT、HFF-1 細胞調整密度至4×104／mL，接種于96 孔板，每孔100 μL，孵育過夜。細胞分為對照組（0 μmol／L）和給藥組（1、2、4、8、16、32 μmol／L，1 μmol／L 藥物為1 μmol隱丹參酮＋1 μmol 丹參酮ⅡA混合溶于1 L 的DMSO），另設空白組（無細胞），給藥培養48 h 后，每孔加入10 μL 5 mg／mL MTT，繼續孵育5 h，于酶標儀595 nm 波長處測定吸光度值，計算細胞增殖抑制率。

2.4.3 劃痕實驗 HaCaT 細胞以無血清培養基培養，給藥濃度為0 μmol／L（0%抑制濃度，丹參酮ⅡA＋隱丹參酮混合物）、1 μmol／L（20% 抑制濃度）、3 μmol／L（50% 抑制濃度），12 h后用10 μL 槍頭在細胞板上劃痕，0、16、32、48 h于倒置顯微鏡下觀察各給藥濃度HaCaT 細胞遷移率。

2.4.4 細胞生長因子檢測 取HFF-1、HaCaT、EA.hy926細胞混懸液，用0%、20%、50%抑制率濃度給藥處理48 h，收集細胞，按照EGF、VEGF-A ELISA 試劑盒說明書檢測EGF、VEGF 水平。

2.4.5 Western blot 法檢測愈傷組織和細胞TGF-β1、TGFβ3、Col1 蛋白表達 分別取愈傷組織樣本和細胞樣本，加150 μL 裂解液超聲1 min 后于0 ℃裂解45、30 min，4 ℃、12 000 r／mim 離心15 min 后吸取上清液，用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，在10% SDS-PAGE 凝膠電泳中分離蛋白質，轉到PVDF 膜上，室溫封閉1 h，加一抗TGF-β1（1∶500）、TGF-β3（1∶500）、Col1（1∶500）、GAPDH（1∶5 000）4 ℃孵育過夜，洗膜3 次后加過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG 二抗，室溫孵育40 min，洗膜3 次后加免疫增強化學發光劑（ECL），顯影，曝光，保存條帶圖進行分析，GAPDH 為內參蛋白。

2.5 統計學分析 通過SPSS 23.0 軟件進行處理，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 滅瘢膏中活性成分 滅瘢膏水、醇提取物經HPLC 分析，結果見圖2～3，滅瘢膏水提取物只含丹參素，含量為0.565 9 mg／g；乙醇提取物中主要含有隱丹參酮、丹參酮ⅡA、二氫丹參酮，含量分別為2.196、2.111、0.346 mg／g，隱丹參酮、丹參酮ⅡA是滅瘢膏中的主要成分。

圖2 滅瘢膏水提取物HPLC 色譜圖

3.2 滅瘢膏對大鼠愈傷組織切片Masson、天狼猩紅染色的影響 如圖4、表1 所示，與對照組、羊脂組比較，滅瘢膏組和丹參酮軟膏組大鼠愈傷組織肌紅纖維水平增加，膠原纖維水平降低（P＜0.01），說明滅瘢膏組和丹參酮軟膏組均具有降低瘢痕形成的作用，滅瘢膏中有效成分為丹參酮類成分。如圖5、表1 所示，滅瘢膏和丹參酮軟膏能增加I 型膠原水平（P＜0.01），說明隱丹參酮、丹參酮ⅡA具有分解膠原纖維或抑制I 型膠原合成膠原纖維的作用。

表1 各組Masson、天狼猩紅染色結果比較（%，±s，n＝8）

表1 各組Masson、天狼猩紅染色結果比較（%，±s，n＝8）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與羊脂組比較，＃＃ P＜0.01。

圖3 各成分HPLC 色譜圖

圖4 各組Masson 染色（×400）

圖5 各組天狼猩紅染色（×400）

3.3 滅瘢膏對大鼠傷口愈合率的影響 第3、7 天時，與對照組比較，滅瘢膏組和丹參酮軟膏組創面愈合率均增加（P＜0.01）；第15 天時，所有大鼠傷口均愈合，接近閉合，說明丹參酮類成分在減少疤痕形成的基礎上不會延緩創面愈合速率，同時在第3、7 天，丹參酮具有促進創面愈合的作用，見表2。

表2 各組大鼠創面愈合率比較（%，±s， n＝8）

表2 各組大鼠創面愈合率比較（%，±s， n＝8）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與羊脂組比較，＃＃P＜0.01。

3.4 滅瘢膏對大鼠愈傷組織VEGF-A、EGF 水平的影響表3 顯示，第7 天，與對照組比較，滅瘢膏組和丹參酮軟膏組大鼠愈傷組織VEGF-A 水平降低（P＜0.05），EGF 水平無明顯變化（P＞0.05）；第15 天，與對照組比較，滅瘢膏組和丹參酮軟膏組大鼠愈傷組織VEGF-A、EGF 水平均升高（P＜0.05），前期抑制血管生成與促進表皮細胞的增殖，說明丹參酮能夠促進愈傷組織正常的增殖發育，同時抑制毛細血管的過度增殖，減少瘢痕相關蛋白的沉積。

表3 各組大鼠愈傷組織VEGF-A、EGF 水平比較（±s， n＝7）

表3 各組大鼠愈傷組織VEGF-A、EGF 水平比較（±s， n＝7）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與羊脂組比較，＃P＜0.05。

3.5 隱丹參酮、丹參酮ⅡA混合物對HFF-1、HaCaT、EA.hy926 細胞增殖活性的影響 隱丹參酮、丹參酮ⅡA混合物對HFF-1、HaCaT、EA.hy926 細胞活性均具有抑制作用（P＜0.01），可避免愈傷組織的過度增殖導致頑固性瘢痕形成，見圖6。隱丹參酮、丹參酮ⅡA混合物48 h 的IC50為HFF-1 細胞29.705 μmol／L，HaCaT 細胞2.904 μmol／L，EA.hy926 細胞11.171 μmol／L。

圖6 各組HFF-1、HaCaT、EA.hy926 細胞增殖抑制率（±s， n＝3）

3.6 隱丹參酮、丹參酮ⅡA混合物對HaCaT 細胞遷移率的影響 與0 μmol／L 組比較，隱丹參酮、丹參酮ⅡA混合物1、3 μmol／L 組16、32 h 空白面積增大（P＜0.01），即細胞遷移率降低；48 h 各組細胞均填充滿原先劃痕位置，劃痕面積為0，見圖7、表4。說明隱丹參酮、丹參酮ⅡA混合物處理后再上皮化速率的降低，HaCaT 細胞上皮-間充質化（EMT）水平下調，避免角質層過早形成、增厚、堆疊，減少角蛋白、膠原纖維過度積累，在不影響創面愈合的前提，抑制肥厚性瘢痕組織的形成。

表4 各組HaCaT 細胞劃痕實驗空白面積比較（±s， n＝3）

表4 各組HaCaT 細胞劃痕實驗空白面積比較（±s， n＝3）

注：與0 μmol／L 組比較，*P＜0.05。

圖7 細胞劃痕實驗結果

3.7 隱丹參酮、丹參酮ⅡA混合物對3 種細胞生長因子分泌的影響 3 種細胞經0、20%、50%抑制濃度的隱丹參酮、丹參酮ⅡA 化合物處理后。隱丹參酮、丹參酮ⅡA混合物各濃度組劑量依賴性地升高HFF-1 細胞中VEGF-A、EGF水平（P＜0.05，P＜0.01），HaCaT 細胞中VEGF-A 水平（P＜0.01），及EA.hy926 細胞VEGF-A 水平（P＜0.01），并降低EA.hy926 細胞EGF 水平（P＜0.01），見圖8。

圖8 3 種細胞VEGF-A、EGF 水平（±s， n＝3）

3.8 各組愈傷組織、細胞中TGF-β1、TGF-β3、Col1 蛋白表達比較 如圖9A～9B 所示，與對照組比較，羊脂組、丹參酮軟膏組、滅瘢膏組TGF-β1、TGF-β3蛋白表達均降低（P＜0.01），說明以羊脂為基質能夠促進隱丹參酮、丹參酮ⅡA混合物的釋放吸收，促進混合物對TGF-β1、TGF-β3表達的抑制作用。如圖9C～9D 所示，與0 μmol／L 組比較，隱丹參酮、丹參酮ⅡA混合物各濃度組HFF-1 細胞Col1 蛋白表達均降低（P＜0.01），說明其具有抑制人皮膚成纖維細胞Col1 的活性。

圖9 各組愈傷組織、細胞中TGF-β1、TGF-β3、Col1 蛋白表達（±s， n＝3）

4 討論

滅瘢膏是一種效果顯著且使用歷史悠久的民間驗方，HPLC 分析發現其中含有的主要活性成分為隱丹參酮、丹參酮ⅡA。前期實驗結果證明，丹參酮ⅡA與隱丹參酮對HFF-1 細胞活性具有抑制作用，且以丹參酮ⅡA的IC50最低，但兩者IC50均高于丹參酮混合物，故使用隱丹參酮與丹參酮ⅡA設計藥理實驗，結果證明隱丹參酮與丹參酮ⅡA混合物為滅瘢膏中發揮藥理作用的主要活性成分。

瘢痕組織形成是愈傷組織過度增殖、膠原纖維和細胞外基質（ECM）過度積累導致的。膠原纖維由膠原蛋白及甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸等構成。膠原蛋白肽鏈中關鍵前肽缺失、Col1 無法重新螺旋生成膠原都會影響膠原纖維合成［14-15］。通過病理染色和蛋白印跡實驗發現，丹參酮混合物可抑制Col1、膠原纖維的合成，并分解膠原纖維生成膠原蛋白以減少膠原纖維在愈傷組織中的沉積。

系統性皮膚硬化病、瘢痕組織增生過程中αvβ3、5 激活TGF-βmRNA 使TGF-β 表達增加［16］，TGF-β1mRNA 及其蛋白表達異常增高是正常皮膚向瘢痕組織轉化的標志［17］；丹參酮混合物可抑制愈傷組織中TGF-β 的分泌，進而降低TGF-β／Smad 通路中p-Smad2、p-Smad3 水平［18］，從而降低TGF-β1對成纖維細胞的增殖促進作用。

藥物載體將創面密封降低氧量，愈傷組織受缺氧誘導因子（HIF-1α）的分泌提升促進VEGF-A 編碼基因的表達從而促進創面中VEGF-A 水平的提升［19-20］。滅瘢膏、丹參酮軟膏處理后生長因子VEGF-A 水平在前期顯著降低并在給藥后期顯著提升，可能在前7 d 時，丹參酮通過影響HIF-1α 亞基與其輔助活化因子CBP／p300 的活化，HIF-1α、HIF-1β 的異源二聚后與缺氧反應原（HRE）、VEGF-AR2受體結合水平降低有關［21］，前期較低的VEGF-A 水平能夠抑制愈傷組織中毛細血管的生成，從而避免愈傷組織的過度增殖而形成瘢痕組織。

本實驗明確了滅瘢膏的主要活性成分為隱丹參酮、丹參酮ⅡA，通過動物和細胞實驗證實了隱丹參酮、丹參酮ⅡA減少瘢痕組織形成的藥理作用，初步闡明了滅瘢膏在傷口愈合時期抑制愈傷組織過度增殖，減少因膠原纖維過度沉積引起的瘢痕形成的機制，為新產品研制和丹參植物資源的開發利用提供了參考。