基于Wnt／β-catenin 探討山藥多糖對高糖誘導心肌細胞損傷的保護作用

2023-03-16 10:15:18宋俊華陳海濱

中成藥 2023年2期

宋俊華，張瀝，陳海濱

（長沙市第四醫院內分泌科，湖南長沙 410006）

糖尿病性心肌病是由糖尿病引起的心肌細胞結構和功能受損的一種疾病［1］，該病在糖尿病患者中很常見，其發生率高達75%［2］。高血糖引起的氧化應激、組織炎癥、細胞凋亡被認為是糖尿病性心肌病發病機理和進展的關鍵［3］。因此，開發抑制糖尿病性心肌病患者氧化應激、組織炎癥水平并降低細胞凋亡，進而降低心肌細胞損傷的治療方法具有重要意義。山藥多糖是山藥中有效成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、增強免疫、降低血糖等作用［4］。相關研究報道，山藥多糖在改善脂多糖誘導的心肌細胞損傷中具有重要作用［5］，而Wnt／β-連環蛋白（Wnt／βcatenin）信號通路作為參與細胞多種生命活動的重要通路之一，抑制該通路可使高糖誘導的H9c2 心肌細胞凋亡率下降［6］，但尚未見山藥多糖通過調控Wnt／β-catenin 信號通路來發揮對高糖誘導心肌細胞損傷的保護作用的報道。因此，本研究通過構建高糖誘導心肌細胞損傷模型，觀察山藥多糖對心肌細胞損傷模型細胞活力、細胞凋亡、氧化應激、炎性因子水平及Wnt／β-catenin 信號通路相關蛋白的影響，旨在探索可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞大鼠心肌細胞H9c2（貨號C5045）購自上海冠導生物工程有限公司。

1.2 試劑與藥物山藥多糖（純度≥90%，貨號SC9990）購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白提取試劑盒、BCA 試劑盒均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；ELISA 試劑盒購自上海恪敏生物科技有限公司；硫代巴比妥酸反應物檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；ROS 檢測試劑盒、Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；黃嘌呤氧化酶活性測定試劑盒、Wnt3α、β-catenin、糖原合成激酶3β（GSK-3β）、GAPDH兔多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG 二抗均購自英國Abcam 公司。

1.3 細胞分組及給藥參照文獻［5，7］報道及前期預實驗結果，將H9c2 細胞隨機分為對照組、高糖組、山藥多糖組、山藥多糖＋LiCl（Wnt／β-catenin 信號通路激活劑）組。對照組以含有5.55 mmol／L 葡萄糖的培養液培養48 h，高糖組以含有33 mmol／L 葡萄糖的培養液培養48 h，山藥多糖組以含有33 mmol／L 葡萄糖和0.20 mg／mL 山藥多糖的培養液培養48 h，山藥多糖＋LiCl 組以含有33 mmol／L 葡萄糖、0.20 mg／mL 山藥多糖和40 μmol／L LiCl 的培養液培養48 h。

1.4 CCK-8 法檢測細胞活力細胞按“1.3” 項下方法處理，收集各組細胞，以每孔1×105個的密度接種在96 孔板中，同時設置只加培養液不加細胞的空白組，每組設置6個復孔，培養72 h 后向每孔中加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃避光孵育2 h，使用酶標儀檢測450 nm 波長處的吸光度值，計算細胞活力。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率細胞按“1.3” 項下方法處理，收集各組細胞（5×105／mL），加入100 μL 結合緩沖液，輕輕重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC 和5μL碘化丙啶，將細胞輕輕混合，并在室溫下避光孵育10 min，使用流式細胞儀分析檢測細胞凋亡率，每組設置6 個復孔。

1.6 細胞ROS、MDA 水平和SOD 活性檢測細胞按“1.3” 項下方法處理，收集各組細胞，分別使用活性氧（ROS）檢測試劑盒（熒光探針法）、丙二醛檢測試劑盒（硫代巴比妥酸法）、超氧化物歧化酶測定試劑盒（黃嘌呤氧化法）檢測細胞ROS、MDA 水平和SOD 活性，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，以相對熒光強度（MFI）值代表ROS 水平，每個樣本重復6 次實驗。

1.7 ELISA 法檢測細胞炎癥因子IL-1β、IL-6 水平細胞按“1.3” 項下方法處理，收集各組細胞上清液，采用ELISA 試劑盒檢測上清液中IL-1β、IL-6 水平，每個樣本重復6 次實驗。

1.8 Western blot 法檢測細胞Wnt3α、β-catenin、GSK-3β蛋白表達細胞按“1.3” 項下方法處理，收集各組細胞，加入預冷的RIPA 緩沖液在4 ℃下裂解45 min，使用BCA試劑盒對總蛋白進行定量。通過12% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質，然后移至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，與一抗β-catenin（1∶2 000）、Wnt3α（1∶1 000）、GSK-3β（1∶3 000）、GAPDH（1∶2 500）在4 ℃下孵育過夜，PBST 洗滌3 次，與HRP 標記的山羊抗兔二抗（1∶5 000）在室溫下孵育2 h，使用ECL 化學發光系統可視化蛋白質條帶，Image J 軟件量化蛋白質條帶，并以GAPDH為內參，分析目的蛋白相對表達，每個樣本重復6 次實驗。

1.9 統計學分析通過SPSS 25.0 軟件進行處理，數據以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 山藥多糖對細胞活力的影響與對照組比較，高糖組細胞活力降低（P＜0.05）；與高糖組比較，山藥多糖組細胞活力升高（P＜0.05）；與山藥多糖組比較，山藥多糖＋LiCl 組細胞活力降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組細胞活力比較（±s， n＝6）