溫度和水活度對柏子仁黃曲霉毒素含量變化的影響

劉震營，王玲娜，姜 秋，蒲高斌，張永清

（山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355）

柏子仁為柏科植物側柏Platycladus orientalis（L.）Franco 的干燥成熟種仁，具有養心安神、潤腸通便、止汗等功效［1］。在中醫藥備受關注的新形勢下，柏子仁市場需求量逐年增加，但因黃曲霉毒素含量超標造成質量不合格的報道層出不窮。黃曲霉毒素是由黃曲霉菌（Aspergillus flavus）與寄生曲霉菌（A.parasiticus）相互作用產生一類次級代謝產物。中藥材容易受污染的黃曲霉毒素主要有黃曲霉 毒素B1（AFB1）、B2（AFB2）、G1（AFG1）和G2（AFG2）4 種。其中AFB1毒性最強，有嚴重的肝毒和致癌、致畸、致突變活性，屬I 類致癌物［2］。

柏子仁經過機器加工時，很容易破碎，造成油脂外溢現象。在脂肪酸過氧化物存在下，黃曲霉毒素生物合成涉及脂質的氧化降解，且在脂肪酸存在下脂質過氧化和黃曲霉毒素合成均會加強［3］。柏子仁脂肪油含量可達48%，為黃曲霉菌生長及黃曲霉毒素產生提供有利條件［4］。在儲藏方面，一般大都常溫儲藏，少數采用冷庫，容易達到霉菌滋生和毒素產生的條件，需要嚴格控制環境條件。目前，關于柏子仁黃曲霉毒素的報道大都基于多種藥材黃曲霉毒素的檢測［5-7］。前人對水活度、溫度影響中藥材黃曲霉毒素積累的研究已經比較深入，不同基質黃曲霉毒素最易產生的條件具有明顯差異［8-12］。本研究探討不同水活度和溫度條件下柏子仁黃曲霉毒素的產毒變化，尋找柏子仁在儲藏等環節能夠有限規避黃曲霉毒素產生的安全范圍，有助于優化生產、加工、倉儲條件，對柏子仁生產加工具有實踐性指導意義。

1 材料

SPL-150 生化培養箱（天津萊玻特瑞儀器設備有限公司）；AW1000T 水分活度測定儀（上海昌琨實業有限公司）；ME204／02 萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；高效液相色譜-串聯三重四級桿質譜聯用儀（美國Agilent 公司）；5810R 高速離心機（德國Eppendorf 公司）；DHM-200 多管漩渦混合儀（寧波洛尚智能科技有限公司）；黃曲霉毒素免疫親和柱（北京華安麥科生物技術有限公司）；MLS-3781L-PC 高壓蒸汽滅菌 鍋（日本Panasonic 公司）；Watson 177-112C 血球計數板（北京中西華大科技有限公司）；DM500 生物顯微鏡（德國Leica公司）。

PDA 培養基（北京索萊寶科技有限公司，批號320H031）；黃曲霉高產毒菌株BNCC142803（北京北納創聯生物技術研究院，批號18051821）；黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合對照品溶液（北京華安麥科生物技術有限公司，批號LRAC0310），質量濃度分別為1.0、0.3、1.0、0.3 mg／L。甲醇（分析純，天津富宇精細化工有限公司）；吐溫-20（北京索萊寶科技有限公司，批號505Q013）；吐溫-80（國藥集團化學試劑有限公司，批號20181205）；甲醇、甲酸（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；溴化鉀（批號20200526）、氯化鉀（批號20191005）、氯化鋇（批號20200509）、硫酸亞鐵（批號20190504）、硝酸鉀（批號20140414）、硫酸鉀（批號20180504）（國藥集團化學試劑有限公司）。

柏子仁收集于山東省濟寧市汶上縣柏子仁加工基地，均為當年產且未受黃曲霉毒素污染，經山東中醫藥大學張永清教授鑒定為柏科植物側柏Platycladus orientalis（L.）Franco 的干燥成熟種仁。

2 方法

2.1 黃曲霉孢子懸浮液制備 將高產毒黃曲霉菌株BNCC142803 轉接到PDA 培養基上，28 ℃生化培養箱中培養7 d，待菌落長滿后用于后續黃曲霉孢子懸浮液制備。于超凈工作臺中用接種棒蘸取適量黃曲霉菌與1%吐溫-80 混合，振蕩搖勻，用無菌滴管吸取少量滴于血球計數板中，在顯微鏡下反復計數，制得密度為1×106／mL 的黃曲霉孢子懸浮液，備用。

2.2 水活度調節 水活度和溫度是在綜合黃曲霉菌繁殖生長及毒素產生條件，采用飽和鹽溶液預平衡法獲得目標水活度（0.80、0.85、0.90、0.92、0.94、0.98）［12-14］。選擇相應的飽和鹽溶液（溴化鉀、氯化鉀、氯化鋇、硫酸亞鐵、硝酸鉀、硫酸鉀）［15］，將不同種類鹽分別放入干燥無菌培養皿中，向其中慢慢滴加水，直到完全溶解達到飽和狀態，將培養皿分別置入干燥器下層（圖1）。稱取一定量柏子仁置于干燥無菌培養皿中，在超凈工作臺中紫外殺菌2 h 后置于干燥器上層，放上蓋子，使其內部形成密閉空間，以達到不同目標的水活度。將所有干燥器放置在25 ℃恒溫實驗室內48 h 后，用水分活度測定儀測定。

圖1 目標水活度調節示意圖

2.3 接種培養 將達到目標水活度的柏子仁置超凈工作臺紫外殺菌2 h，稱取80 g 放入已滅菌具塞錐形瓶中，加入3 mL黃曲霉孢子懸浮液，振蕩，混勻，倒入培養皿，均勻鋪開。然后置于事先設定好溫度（20、25、28、32、36、40、42 ℃）并紫外滅菌2 h 的生化培養箱中培養7 d。每組實驗均設置3 個平行樣品。

2.4 黃曲霉毒素含量測定 稱取8 g 培養7 d 后的柏子仁，于液氮中研磨。精密稱取5 g，置50 mL 離心管中，加入1 g氯化鈉和25 mL 70% 甲醇混勻，振蕩，渦旋5 min，2 500 r／min 離心3 min，取10 mL 上清液，加入40 mL 1%吐溫稀釋，用快速定量濾紙過濾，收集濾液為上樣液，待凈化洗脫。取25 mL 上樣液注入免疫親和柱中，待液體排干后，用10 mL 水洗滌2 次，棄去全部洗脫液。待液體排干后，加入1 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液并定容至1 mL。洗脫液用0.22 μm 微孔濾膜過濾，用于HPLC-MS／MS分析。

分析條件為HALO 90A C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流動相0.1% 甲酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～4 min，80%～62% A；4～10 min，62%～30% A；10～10.20 min，30%～0A；10.20～15 min，0～80% A）；柱溫40 ℃；體積流量0.25 mL／min；進樣量3 μL。電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描；多反應監測模式；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣體積流量10 L／min；毛細管電壓4 000 V。4種黃曲霉毒素的相關質譜參數見表1。

表1 黃曲霉毒素質譜參數表

3 結果

3.1 溫度對柏子仁黃曲霉毒素含量的影響 圖2 顯示溫度對柏子仁AFB1含量變化的影響，在水活度0.80 時，20、25 ℃均不產生AFB1。28 ℃開始有AFB1產生，但含量相對較少，隨著溫度升高AFB1含量增加，至32 ℃時達到最大，然后逐漸降低，40 ℃時AFB1含量低于28 ℃。在水活度0.85 時，AFB1的產生趨勢與水活度0.80 時相似，但初始產生溫度從28 ℃降為25 ℃。在水活度0.90～0.92 時，均為25 ℃開始產生AFB1，且產毒量相對較高，至28 ℃便達到最高。在水活度0.94～0.98 時，AFB1最大產生量均發生在32 ℃，但25 ℃時水活度0.94 下AFB1產生量明顯高于水活度0.98。

圖2 溫度對AFB1 含量的影響

對于AFB2，不同溫度下含量不同（圖3）。25 ℃時，水活度0.85、0.94、0.98 產毒最多。28 ℃時，水活度0.90 產毒最多；28～32 ℃區間不同水活度下均下降；36～42 ℃區間，水活度0.80、0.85、0.90、0.94 呈先上升后下降的趨勢；42 ℃時，不同水活度均無AFB2產生。AFG1和AFG2在任何溫度下均未檢測到。

圖3 溫度對AFB2 含量的影響

隨著溫度升高，黃曲霉毒素總量呈現先上升后下降（圖4）。20 ℃時，4 種黃曲霉毒素均未產生。隨著溫度升高，不同水活度條件下產毒量逐漸升高，28 ℃為水活度0.85、0.90、0.92 條件下最適產毒溫度，其中在水活度0.90、0.92 時產毒量已超過2020 年版《中國藥典》 規定標準。32 ℃為水活度0.80、0.94、0.98 時最適產毒溫度，隨著溫度升高，黃曲霉毒素總量開始下降。在42 ℃，未產生黃曲霉毒素。

圖4 溫度對AFs 含量的影響

3.2 水活度對柏子仁黃曲霉毒素含量的影響 圖5 結果顯示不同水活度下AFB1含量的變化。在20、42 ℃時，均不會產生AFB1。25 ℃時，水活度0.80 無AFB1產生，水活度0.90 時AFB1產生量最多。28 ℃時，水活度0.80 產生AFB1但含量較低。AFB1均在水活度0.90 時含量最高，且25、28、32、36 ℃下產毒量已超過限量標準。

圖5 水活度對AFB1 含量的影響

AFB2在不同水活度下含量不同（圖6）。水活度0.85時，25、28 ℃條件下產毒最多。隨著水活度不斷升高，大部分溫度條件下產毒量下降，其中在水活度0.92～0.98 區間，36、40 ℃條件下產毒量呈先升高后下降。AFG1和AFG2在任何水活度下均未檢測到。

圖6 水活度對AFB2 含量的影響

水活度對柏子仁AFs 的影響參見圖7。隨著水活度升高，黃曲霉毒素總量上升，水活度0.90 時，黃曲霉毒素總量最高，隨溫度升高下降。

圖7 水活度對AFs 含量的影響

4 討論

本研究檢測4 種黃曲霉毒素，除低溫和高溫、部分低水活度條件外，均檢出AFB1、AFB2。水活度作為黃曲霉菌產生黃曲霉毒素的一個測定指標，表示藥材中的水與其他物質結合的緊密程度，是影響微生物生長的關鍵因素之一［16］。相比于水分含量，它能夠反映產品儲藏的穩定性，廣泛用于藥材質量與安全控制。

未來在柏子仁儲存過程中，應重點防控AFB1和AFs的污染狀況。在28 ℃、水活度0.90 時，柏子仁的黃曲霉菌產毒能力最強，毒素含量最高。在20、42 ℃時，水活度變化均不會產生黃曲霉毒素，推測這2 個溫度點均限制與黃曲霉毒素產生相關基因的表達。一般選擇低溫儲藏，高溫儲藏會促進其他真菌的繁殖生長。在水活度0.80 時，各溫度條件下黃曲霉毒素產生量最低。由此可將20 ℃、水活度0.80 作為柏子仁黃曲霉毒素安全控制點。