中藥體外抗紅色毛癬菌效應研究

蘇 曼王 昊黃玉浩周文明顧 薇*陳 軍

（1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023； 2.江蘇省中醫外用藥開發與應用工程研究中心，江蘇南京 210023； 3.江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心，江蘇 南京 210023； 4.連云港市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 連云港 222000； 5.安徽老孫頭鞋業有限公司，安徽 宿州 235200； 6.上海楊思醫院，上海 200126； 7.江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇 南京 210023）

手癬、足癬中醫又稱鵝掌風、腳濕氣，是一種常見的皮膚科真菌感染性疾病，其發病率高、難以痊愈、易反復發作、傳染性強，極大影響人類健康和生活質量。足癬分為水皰型、浸漬糜爛型、角化過度型、丘疹鱗屑型，引發的致病真菌包括紅色毛癬菌、絮狀表皮癬菌、趾間毛癬菌、石膏樣小孢子菌、犬小孢子菌等，其中紅色毛癬菌是主要致病真菌，在臨床檢測中占80%左右，其次是須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌等［1-5］。

目前手足癬的治療多以西藥為主，以唑類和丙烯胺類藥物為代表，而西藥的耐藥問題是很多患者久治不愈的關鍵原因。中藥具有來源廣泛、毒副作用小、廣譜、藥效長等優點，可在真菌細胞內產生多方面的藥理效應，而很少出現耐藥，適用于病程較長的皮膚癬菌病［6］。檢索2020 年版《中國藥典》 《方劑大辭典》 《欽定四庫全書子部·腳氣治法綱要卷》及臨床試驗論文，篩選分析其中治療手足癬的中藥復方，結合臨床醫師建議，系統篩選得到26 味手足癬復方中的常用藥材（表1），其以辛溫、苦寒藥材為主。本研究以紅色毛癬菌為評價菌種，考察26 味中藥的抑菌效果，對藥效顯著的藥材進行成分分析與效應物質研究，為中藥抗真菌藥物的臨床選用、配伍與機制研究提供科學依據。

1 材料

BSC-1604IIA2 型生物安全柜，蘇州安泰空氣技術有限公司；ULTROSPEC 10 CLASSIC 濁度儀，美國Harvard Apparatus 公司；B6120 型培養箱，美國Thermo Fisher 公司；Epoch2 TC 型酶標儀，美國BioTek 公司；PB21 型PH 儀，德國賽多利斯公司；AG135 十萬分之一天平、XS205 型電子天平，瑞士Mettler-Toledo 公司；Ti-S 型顯微鏡，日本尼康公司；704767-C100002 型培養皿，青島阿爾發醫療器械有限公司；Agilent 1260 Infinity HPLC、Agilent 6530B Accurate-Mass Q-TOF，美國Agilent 公司；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。Trichophyton rubrumATCC MYA-4438 購自美國ATCC 中心。

中藥飲片（表1）均購自亳州紫銳藥業有限公司、蘇州市天靈中藥飲片有限公司，由南京中醫藥大學藥學院劉圣金副教授鑒定為正品。氟康唑（批號F8929-100MG）、MOPs（批號M1254-1KG）購自美國Sigma 公司；RPMI 1640 粉末（批號Gibco-31800-022）購自美國Invitrogen 公司；馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養基（批號HB0233-12）購自青島海博生物有限公司。土荊皮丙酸（成都格利普生物科技有限公司，批號18033002）；土荊皮乙酸（大連美侖生物科技有限公司，批號J0826AS）；氧化苦參堿、歐前胡素、苦參堿、蛇床子 素、丁香酚（批號 Y30S6Y17043、D07S10E97290、T03F9F54046、T08M8B30733、H22A10Z86166，上海源葉生物科技有限公司）；乙酰基丁香酚、百部堿（南京金益柏生物科技有限公司，批號191103、190321）；苦參酮（成都格利普生物科技有限公司，批號190120）。

表1 處方分析篩選出的27 味藥材

2 方法

2.1 藥材提取 將藥材粉碎后過2 號篩，精密稱定10 g 于具塞錐形瓶中，加10 倍量75%乙醇，50 ℃水浴鍋中浸泡12 h 后，50 ℃超聲處理1 h，過濾后取濾液，于旋轉蒸發儀揮干溶劑，50 ℃烘箱烘干48 h，得中藥提取物，－20 ℃條件下保存。

2.2 體外抗紅色毛癬菌的藥效研究 實驗過程遵照美國臨床實驗室標準化協會標準，以最低抑制濃度（MIC）為評價指標，考察藥物／化合物抗紅色毛癬菌藥效。

將冷凍保存的紅色毛癬菌甘油管劃線接種PDA 平板，置于35 ℃、相對濕度80%條件下培養6 d。用5 mL 0.9%NaCl 溶液覆蓋平板，用涂布器輕輕刮平板表面，獲得孢子懸液。稀釋100 倍，使用顯微鏡及紅細胞計數器進行計數。計數結果為47、57、44、54，則原液孢子為505 000／mL。將800 μL 菌液加至250 mL 測試培養基，獲得接種液。

將待測化合物及氟康唑溶解于DMSO，配制成待測化合物51.2 mg／mL、氟康唑12.8 mg／mL。將氟康唑用DMSO稀釋2 倍（即6.4 mg／mL），備用。待測化合物在96 孔板中進行梯度稀釋，得到質量濃度51.2、25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0 mg／mL 的溶液。氟康唑在96 孔板中進行梯度稀釋，得到質量濃度6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25、0 mg／mL 的溶液。從化合物母板中轉移2 mL 化合物工作液，加于含培養基的96-U 孔板，獲得化合物檢測板。所有組別平行3 份。在化合物檢測板中加入198 μL 各真菌接種液，獲得MIC 檢測板。將MIC 檢測板置于35 ℃、相對濕度80% 條件下，靜置培養4 d 后讀取MIC 數值［6］。用油鏡觀察藥材在MIC 濃度培養后的菌絲狀態。

2.3 色譜條件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，2.7 μm）；流動相乙腈（A）-水（含0.1%甲酸）（B），丁香、蛇床子、百部、大黃、土荊皮按表2 進行梯度洗脫，苦參按表3 進行梯度洗脫；柱溫30 ℃；體積流量0.3 mL／min；進樣量1 μL。

表2 梯度洗脫程序

表3 梯度洗脫程序

2.4 質譜條件 毛細管電壓5 500 V（正離子模式）、－4 500 V（負離子模式）；洗脫溶劑溫度550 ℃；氣簾氣壓力241.3 kPa；霧化器壓力379.2 kPa。取“2.1” 項下制備供試品，用75%乙醇稀釋100 倍，離心后取上清液進樣測定。

2.5 藥材成分數據庫的建立與分析 利用TCMSP 數據庫及文獻數據建立中藥的成分數據庫。利用MassHunter 對藥材的質譜圖進行成分分析，與自建數據庫中成分匹配，篩選出相對含量大于1%的成分，成分的二級質譜碎片與標準品質譜數據、Massbank 數據庫進行比對。

3 結果

3.1 體外抗紅色毛癬菌藥效 苦參、土荊皮的抑菌效果最好，MIC 值為64 μg／mL；大黃、丁香、蛇床子、百部具有較好的抑菌效應，MIC 值為64 μg／mL，見表4。

表4 對紅色毛癬菌最小抑菌濃度（MIC）

選取抗紅色毛癬菌效果優良的6 味中藥（苦參、土荊皮、大黃、丁香、蛇床子、百部），用油鏡觀察其在MIC 濃度培養后的菌絲狀態（圖1）。6 味中藥提取物不同程度地展現出對紅色毛癬菌細胞壁與細胞膜的破壞作用，菌絲細胞壁均有融合的趨勢［6］。

圖1 紅色毛癬菌油鏡圖

3.2 成分分析 各中藥提取物與相應混合對照品的提取離子色譜圖見圖2。以MassHunter 對離子色譜圖進行分析，根據加合離子［M＋H］＋信息判斷并得到一級質譜精確相對分子質量，通過MassHunter 軟件數據庫擬合化合物分子式，將結果與文獻及數據庫進行比對，對各色譜峰進行初步推測。篩選信噪比較好的二級質譜圖以獲取色譜峰的二級質譜信息，并獲得化合物相應的碎片離子，根據離子的裂解情況及文獻數據比對并推測化學成分。將相對含量較高成分與標準品的二級譜圖進行比對，對成分進行確認，見表5。

表5 藥材成分分析

圖2 離子色譜圖

3.3 抗紅色毛癬菌作用機制 土荊皮乙酸、歐前胡素、蛇床子素、苦參酮均顯示較強抗紅色毛癬菌的抑菌作用，MIC值為16 μg／mL，其土荊皮丙酸、苦參堿、氧化苦參堿、百部堿等成分無抗紅色毛癬菌作用，結果見表6。

表6 對紅色毛癬菌最小抑菌濃度（MIC）

4 討論

篩選出的6 味藥材對紅色毛癬菌菌絲的細胞壁均有不同程度的融合趨勢。破壞細胞壁及細胞膜的完整性正是大部分天然提取物對真菌作用的主要機理［7-11］，抑菌效果最好的是苦參和土荊皮。中醫的辨證論治認為本病多因濕熱下注或血虛風燥引起，亦可因接觸患者的用具沾染蟲毒導致［12］。香豆素類成分歐前胡素、蛇床子素和土荊皮乙酸對紅色毛癬菌有較好的抑菌效果，丁香酚、乙酰基丁香酚、苦參酮有一定的抑菌效果［13-15］。苦參堿、氧化苦參堿、百部堿無抗紅色毛癬菌效應，這可能與菌種差異有關［16-17］。一種藥物對不同菌株的作用不同，可能與其作用靶點不同有關［18］。

以紅色毛癬菌為代表的足癬真菌多適宜在堿性環境下生長，故將患處浸泡于酸性環境是臨床上治療足癬的常用方法［19-20］。對紅色毛癬菌有較好抑制作用的6 種成分均顯示不同程度的酸性，如乙酰基丁香酚、土荊皮乙酸因具羧基而顯酸性，丁香酚、苦參酮因具酚羥基而顯示出一定的酸性，香豆素類化合物則多呈中性或弱酸性；相反，生物堿類成分卻顯示較弱抗紅色毛癬菌效應，提示中藥成分對真菌生長環境酸堿性的改變可能是發揮其抗菌抑菌作用的重要原因［21］。同時，正常人表面皮膚呈弱酸性，保持正常的酸性狀態也是保護皮膚抗細菌和真菌侵害的重要條件［22］。

本研究從篩選抗菌藥物到藥效物質基礎，一定程度闡釋中藥抗菌的機制，為針對紅色毛癬菌引起的皮膚疾病的藥物研制提供科學依據。