黃柏酮對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻模型小鼠腎間質(zhì)纖維化及鐵死亡的影響 Δ

邱莎 ，楊麗 ，譚睿陟 ，劉建 ， （.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科/四川省腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，四川 瀘州 646000；.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心，四川 瀘州 646000；.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川 瀘州 646000）

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）的發(fā)病率逐年上升，已成為全球性公共衛(wèi)生問題[1]。腎間質(zhì)纖維化幾乎是所有CKD進(jìn)展至終末期的共同途徑，延緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程是治療CKD的關(guān)鍵[2]。鐵死亡是近年來新發(fā)現(xiàn)的鐵依賴性、非凋亡的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡方式，核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2?related factor 2，Nrf2）、谷胱甘肽過氧化物酶4（gluta?thione peroxidase 4，GPx4）是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)控因子[3]。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)CKD患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的鐵代謝紊亂和脂質(zhì)代謝紊亂，鐵代謝紊亂可導(dǎo)致鐵在腎臟中沉積，進(jìn)而誘導(dǎo)鐵死亡；脂代謝紊亂可導(dǎo)致腎實(shí)質(zhì)脂質(zhì)沉積，促進(jìn)脂質(zhì)過氧化，進(jìn)一步誘導(dǎo)鐵死亡[4]。

黃柏酮是從黃柏、白鮮皮等植物中提取的天然化合物，屬于檸檬苦素類三萜化合物，具有抗炎[5]、抗氧化[6]、抗腫瘤[7]等多種藥理活性?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，黃柏酮是一種強(qiáng)效的Nrf2激動(dòng)劑，可以延緩常染色體顯性遺傳性多囊腎病中腎囊腫的進(jìn)展[8]，有效緩解肺纖維化[9]、肝纖維化[10]，但其對(duì)腎間質(zhì)纖維化的改善作用及機(jī)制仍不清楚。因此，本研究探索黃柏酮對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻（unila?teral ureteral obstruction，UUO）模型小鼠腎間質(zhì)纖維化的影響，并通過Nrf2/GPx4信號(hào)通路探討其作用機(jī)制，以期為黃柏酮的藥理研究及開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括LightCycler480 Ⅱ型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（瑞士Roche公司），Mini?Protein Tetra System型蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)（美國 Bio?Rad 公司），DM500型生物顯微鏡（日本Olympus公司），Synergy2型多功能酶標(biāo)儀（美國Bio?Tek公司）。

1.2 主要藥品與試劑

黃柏酮（批號(hào)PCS?211109，純度≥98%）購自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；蘇木精?伊紅（HE）染色試劑盒、羊抗兔免疫球蛋白G（批號(hào)分別為C0105S、A0208）購自上海碧云天科技有限公司； Masson染色試劑盒（批號(hào)BA4079A）購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；肌酐（creatinine，Cr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T?SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所有限公司（批號(hào)分別為C011?2?1、C013?2?1、A001?1?2、A003?1?2）；Fe2+濃度檢測(cè)試劑盒購自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司（批號(hào)I291）；免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司（批號(hào)分別為PV?9000、ZLI?9018）；兔抗GAPDH多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司（批號(hào)60004?1）；兔抗小鼠Nrf2、α?平滑肌肌動(dòng)蛋白（α?smooth muscle actin，α?SMA）單克隆抗體購自美國CST公司（批號(hào)分別為 12721T、19245S）；兔抗小鼠纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)n）、GPx4、溶質(zhì)載體家族7成員11（SLC7A11）多克隆抗體購自美國Abcam公司（批號(hào)分別為ab2413、ab125066、ab216876）。本研究所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為健康SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量22～25 g，6～8周齡，購自成都藥康生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（川）2020?034。小鼠于12 h光照、12 h黑暗環(huán)境中常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。本實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南（GB/T 35892?2018）》要求執(zhí)行，經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為swmu20220107。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將30只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、厄貝沙坦組（陽性對(duì)照，20 mg/kg，劑量為臨床等效劑量）和黃柏酮低、高劑量組（10、40 mg/kg，低劑量參考文獻(xiàn)[11]設(shè)置），每組6只。除假手術(shù)組外，其余各組小鼠均通過結(jié)扎單側(cè)輸尿管建立UUO模型，具體造模方法參考文獻(xiàn)[12]：小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，以75%乙醇消毒右側(cè)背部毛發(fā)及皮膚，從小鼠背部右側(cè)靠近腎臟位置切開1～2 cm的切口；逐層切開皮膚、肌肉各層，暴露并分離右側(cè)腎臟及輸尿管，使用手術(shù)線4?0對(duì)輸尿管近腎端進(jìn)行雙結(jié)扎，中間剪斷，逐層縫合。假手術(shù)組除不結(jié)扎、不剪斷輸尿管外，其余操作相同。術(shù)后，給藥組小鼠腹腔注射相應(yīng)藥物，假手術(shù)組、模型組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。

2.2 樣本采集

術(shù)后第8天，小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血，室溫放置30 min，于4 ℃ 條件下以3 500 r/min離心10 min，取上層血清，用于檢測(cè)Cr、BUN水平，MDA含量以及T?SOD活力。取血完成后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，摘取右側(cè)腎臟，去除包膜并用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后將其分為2份：一份放入10%甲醛溶液中固定，用于病理切片染色和免疫組化分析；一份保存于－80 ℃，用于Fe2+濃度測(cè)定及Western blot、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。

2.3 小鼠腎功能指標(biāo)的檢測(cè)

取“2.2” 項(xiàng)下各組小鼠血清樣品適量，根據(jù)相應(yīng)試劑盒說明書方法操作，檢測(cè)Cr、BUN的水平。

2.4 小鼠腎臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察

取“2.2”項(xiàng)下各組小鼠固定于10%甲醛溶液中的腎臟組織，用水沖洗，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，切片（厚度為4 μm）備用。取部分切片于65 ℃烘烤2 h后用二甲苯脫蠟、梯度酒精復(fù)水，經(jīng)HE染料（蘇木精染色5 min，伊紅染色40 s）染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織的病理形態(tài)學(xué)改變；再取部分切片經(jīng)脫蠟復(fù)水后參照說明書方法進(jìn)行Masson染色，以評(píng)估腎臟組織纖維化情況。

2.5 小鼠腎臟組織中Fe2+濃度及血清中MDA含量、T?SOD活力的檢測(cè)

取“2.2”項(xiàng)下各組小鼠凍存的腎臟組織適量（約100 mg），以冷PBS洗凈，根據(jù)Fe2+濃度檢測(cè)試劑盒說明書方法操作，計(jì)算腎臟組織中Fe2+濃度。另取“2.2”項(xiàng)下各組小鼠的血清樣品適量，根據(jù)MDA、T?SOD試劑盒說明書方法操作，計(jì)算小鼠血清中MDA含量及T?SOD活力。

2.6 小鼠腎臟組織中Fn、α?SMA、Nrf2、GPx4蛋白陽性表達(dá)的檢測(cè)

采用免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.4”項(xiàng)下各組小鼠剩余部分的切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、水化后，用檸檬酸二鈉抗原修復(fù)液（pH6.0）熱修復(fù)10 min，待切片溫度降至室溫后，根據(jù)免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作，然后滴加Fn（稀釋度為1∶200）、α?SMA（稀釋度為1∶200）、Nrf2（稀釋度為1∶100）、GPx4（稀釋度為1∶200）抗體，4 ℃孵育過夜，使用DAB顯色試劑盒顯色，終止顯色后再以蘇木素復(fù)染切片3 min，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后，采用顯微鏡進(jìn)行觀察，棕色越深表明目的蛋白表達(dá)越強(qiáng)。

2.7 小鼠腎臟組織中Fn、α?SMA、Nrf2、GPx4、SLC7A11蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.2”項(xiàng)下各組小鼠凍存的腎臟組織適量（約100 mg），剪碎、冰上研磨，添加預(yù)冷的蛋白裂解液冰上裂解20 min，超聲（功率200 W，頻率20 kHz）處理2 s×5次，于4 ℃ 條件下以12 000 r/min離心10 min；吸取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度后，煮沸變性，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，分別加入Fn、α?SMA、Nrf2、GPx4、SLC7A11、GAPDH抗體（稀釋度均為1∶1 000），4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入二抗（稀釋度為1∶10 000），室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，置于凝膠成像系統(tǒng)下成像。采用Image J軟件進(jìn)行灰度值量化分析，以目的蛋白與GAPDH的灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.8 小鼠腎臟組織中Fn、α?SMA、Nrf2、GPx4、SLC7A11 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.2”項(xiàng)下各組小鼠凍存的腎臟組織適量，使用Trizol試劑提取小鼠腎組織中的總RNA，經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定其含量后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為上下游引物各1 μL、2×擴(kuò)增試劑10 μL、cDNA模板2 μL、無酶水6 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 20 s，共 40 個(gè)循環(huán)。使用GAPDH作為內(nèi)參基因，通過2－ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的表達(dá)水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 9.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD?t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 黃柏酮對(duì)小鼠腎功能指標(biāo)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清中Cr、BUN水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中Cr、BUN水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠腎功能指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

表2 各組小鼠腎功能指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

a：與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組厄貝沙坦組黃柏酮低劑量組黃柏酮高劑量組Cr/（μmol/L）19.53±1.93 39.93±2.09a 30.58±1.46b 29.57±1.50b 26.81±2.66b BUN/（mmol/L）3.92±0.57 8.40±0.94a 4.31±0.87b 4.81±0.60b 4.68±0.08b

3.2 黃柏酮對(duì)小鼠腎臟組織病理形態(tài)學(xué)的影響

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組小鼠腎臟組織正常無病變，腎小管飽滿；模型組小鼠腎臟組織中腎小管擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞可見疏松、腫脹和空泡變性，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤明顯；經(jīng)厄貝沙坦、黃柏酮干預(yù)后，小鼠腎小管擴(kuò)張、上皮細(xì)胞空泡變性，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤均較模型組減少，病變程度減輕，且黃柏酮高劑量組減輕得更明顯。Masson染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)完整，基本無藍(lán)色膠原陽性著色區(qū)域；模型組小鼠腎臟出現(xiàn)了明顯的膠原沉積，纖維條索較粗且著色較深；經(jīng)厄貝沙坦、黃柏酮干預(yù)后，小鼠腎臟膠原沉積均較模型組減少，且黃柏酮高劑量組減少更明顯。結(jié)果見圖1（黃柏酮低劑量組略）。

圖1 各組小鼠腎臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果（×400）

3.3 黃柏酮對(duì)小鼠腎臟組織中Fe2+濃度和血清中MDA含量、T?SOD活力的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腎臟組織中Fe2+濃度和血清中MDA含量均顯著升高（P＜0.05），血清中T?SOD活力顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，厄貝沙坦組和黃柏酮各劑量組小鼠腎臟組織中上述指標(biāo)均顯著逆轉(zhuǎn)（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠腎臟組織中Fe2+及血清MDA含量、T?SOD活力的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

表3 各組大鼠腎臟組織中Fe2+及血清MDA含量、T?SOD活力的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

a：與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組厄貝沙坦組黃柏酮低劑量組黃柏酮高劑量組Fe2+濃度/（nmol/mg prot）0.07±0.012 0.31±0.008a 0.22±0.008b 0.14±0.005b 0.10±0.005b MDA/（nmol/L）5.65±0.20 11.31±0.27a 9.76±0.17b 7.62±0.56b 6.55±0.27b T?SOD/（U/mL）117.09±1.64 71.18±1.59a 99.80±1.94b 105.51±3.06b 111.55±2.74b

3.4 黃柏酮對(duì)小鼠腎臟組織中Fn、α?SMA、Nrf2、GPx4蛋白陽性表達(dá)的影響

假手術(shù)組小鼠腎臟組織中有少量Fn、α?SMA表達(dá)，有大量Nrf2、GPx4表達(dá)；與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腎臟組織中可見大量Fn、α?SMA表達(dá)，少量Nrf2、GPx4表達(dá)；與模型組相比，厄貝沙坦組和黃柏酮各劑量組小鼠腎臟組織中上述蛋白表達(dá)均明顯逆轉(zhuǎn)。結(jié)果見圖2（黃柏酮低劑量組略）。

圖2 各組小鼠腎臟組織中Fn、α?SMA、Nrf2、GPx4蛋白表達(dá)的免疫組化圖（×400）

3.5 黃柏酮對(duì)小鼠腎臟組織中 Fn、α?SMA、Nrf2、GPx4、SLC7A11蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腎臟組織中Fn、α?SMA蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），Nrf2、GPx4、SLC7A11蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，厄貝沙坦組和黃柏酮各劑量組小鼠腎臟組織中上述蛋白（厄貝沙坦組Fn、GPx4除外）表達(dá)水平均顯著逆轉(zhuǎn)（P＜0.05）。結(jié)果見圖3、表4。

表4 各組小鼠腎臟組織中Fn、α?SMA、Nrf2、GPx4、SLC7A11蛋白表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）

表4 各組小鼠腎臟組織中Fn、α?SMA、Nrf2、GPx4、SLC7A11蛋白表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）

a：與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組厄貝沙坦組黃柏酮低劑量組黃柏酮高劑量組Fn/GAPDH 0.22±0.05 0.86±0.02a 0.72±0.08 0.58±0.07b 0.34±0.07b α?SMA/GAPDH 0.22±0.02 1.08±0.04a 0.76±0.02b 0.77±0.02b 0.62±0.05b Nrf2/GAPDH 1.14±0.01 0.39±0.01a 0.79±0.02b 0.84±0.01b 1.12±0.03b GPx4/GAPDH 1.42±0.03 0.79±0.02a 0.64±0.02b 1.01±0.03b 1.08±0.04b SLC7A11/GAPDH 1.27±0.03 0.48±0.02a 0.55±0.02b 0.65±0.03b 0.94±0.01b

圖3 各組小鼠腎臟組織中Fn、α?SMA、Nrf2、GPx4、SLC7A11蛋白表達(dá)的電泳圖

3.6 黃柏酮對(duì)小鼠腎臟組織中 Fn、α?SMA、Nrf2、GPx4、SLC7A11 mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腎臟組織中Fn、α?SMA mRNA的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），Nrf2、GPx4、SLC7A11 mRNA的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，厄貝沙坦組和黃柏酮各劑量組小鼠腎臟組織中Fn、α?SMA mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），GPx4 mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；黃柏酮各劑量組Nrf2 mRNA和高劑量組SLC7A11 mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表5。

表5 各組小鼠腎臟組織中Fn、α?SMA、Nrf2、GPx4、SLC7A11 mRNA表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）

表5 各組小鼠腎臟組織中Fn、α?SMA、Nrf2、GPx4、SLC7A11 mRNA表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）

a：與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組厄貝沙坦組黃柏酮低劑量組黃柏酮高劑量組Fn mRNA 1.06±0.08 28.28±1.41a 5.09±0.99b 19.1±3.73b 1.56±0.17b α?SMA mRNA 1.04±0.05 20.99±0.90a 8.96±1.04b 9.76±0.29b 5.45±0.45b Nrf2 mRNA 1.03±0.03 0.06±0.01a 0.14±0.02 0.64±0.04b 0.73±0.06b GPx4 mRNA 1.02±0.06 0.24±0.01a 0.42±0.02b 0.47±0.02b 0.78±0.11b SLC7A11 mRNA 1.01±0.11 0.21±0.01a 0.28±0.03 0.34±0.03 0.42±0.03b

4 討論

眾所周知，CKD因具有患病率高、知曉率低、醫(yī)療花費(fèi)高的特點(diǎn)，早已成為全球范圍內(nèi)危害人類健康的公共衛(wèi)生問題，其中腎間質(zhì)纖維化是CKD的主要病理表現(xiàn)[2]。目前，臨床上抗腎纖維化的常規(guī)化學(xué)藥物不能有效阻止腎纖維化的進(jìn)展，因此，常用含中藥成分的藥物進(jìn)行輔助治療，這已成為CKD一體化治療方案不可或缺的補(bǔ)充治療手段之一[13―14]。

黃柏酮是從黃柏、白鮮皮植物中提取的天然化合物，有研究證明，黃柏酮對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化、博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化具有改善作用[9―10]。由此可知，黃柏酮對(duì)纖維化具有較好的改善作用?；诖?，本研究建立經(jīng)典的UUO小鼠模型，觀察黃柏酮對(duì)小鼠腎間質(zhì)纖維化的影響。Fn是一種主要的細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，與纖維化程度密切相關(guān)，其表達(dá)水平越高，纖維化程度越重[15]；α?SMA是肌成纖維細(xì)胞的特征蛋白，常作為評(píng)估纖維化程度的重要指標(biāo)[16]。本研究病理學(xué)形態(tài)觀察和相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)黃柏酮干預(yù)后，UUO模型小鼠腎臟組織病理形態(tài)及膠原沉積明顯改善，同時(shí)小鼠血清中Cr、BUN水平，F(xiàn)n、α?SMA蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著降低。這表明，黃柏酮對(duì)UUO模型小鼠的腎臟功能具有保護(hù)作用，且可改善其腎間質(zhì)纖維化。

鐵死亡涉及包括腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)退行性變、肝病等多種疾病的病理過程，有望成為研發(fā)藥物和治療疾病的有效靶點(diǎn)[17]。相關(guān)研究證明，鐵死亡與糖尿病腎病中的腎小管細(xì)胞死亡相關(guān)[18]，抑制鐵死亡可以減輕UUO模型小鼠的腎纖維化[19]。鐵死亡的主要生化特征包括Fe2+濃度升高、活性氧（reactive oxygen species，ROS）堆積、脂質(zhì)過氧化物積累，其中ROS堆積常伴有MDA含量增加和T?SOD活力降低[3]。Nrf2是一種堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)其受到外界氧化應(yīng)激因子刺激后，活化進(jìn)入細(xì)胞核，從而與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合發(fā)揮抗氧化作用[20]。Nrf2還可以啟動(dòng)其下游與鐵死亡密切相關(guān)的靶基因SLC7A11、GPx4等[21]。SLC7A11又名xCT，屬于溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)家族，其編碼的胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體（cystine/glutamate antiporter，System Xc?）通過維持氧化還原的穩(wěn)定狀態(tài)來充當(dāng)鐵死亡的負(fù)向調(diào)節(jié)劑；System Xc?還可介導(dǎo)胱氨酸和谷氨酸在細(xì)胞內(nèi)外的交換作用，其中胱氨酸在細(xì)胞內(nèi)可先被還原為半胱氨酸，再合成谷胱甘肽[22]。GPx4又名磷脂過氧化氫谷胱甘肽過氧化物酶，是已知的唯一能夠直接清除脂質(zhì)過氧化物的酶，可在谷胱甘肽的輔助作用下，將有害的脂質(zhì)過氧化物還原為無害的物質(zhì)，從而阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而抑制鐵死亡[23]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠腎臟組織中Fe2+濃度和血清中MDA含量均顯著升高，血清中T?SOD活力顯著降低，提示鐵死亡的發(fā)生；經(jīng)黃柏酮干預(yù)后，小鼠腎臟組織中Fe2+濃度和血清中MDA含量均顯著降低，血清中T?SOD活力顯著升高，腎臟組織中Nrf2、GPx4、SLC7A11 mRNA（黃 柏 酮 低 劑 量 組SLC7A11 mRNA除外）和蛋白的表達(dá)水平均顯著升高。這表明黃柏酮可通過激活Nrf2/GPx4信號(hào)通路來抑制鐵死亡，從而改善UUO模型小鼠腎間質(zhì)纖維化。

綜上所述，黃柏酮可改善UUO模型小鼠的腎間質(zhì)纖維化，具體作用機(jī)制可能與激活Nrf2/GPx4信號(hào)通路、抑制鐵死亡有關(guān)。