不同FSH處理方法對多浪羊FSH、LH、E2和P4激素水平及發情的影響

牛志剛，呂松杰，丁煜恭，王新海，司衣提·克熱木，史洪才*

(1.新疆畜牧科學院生物技術研究所，新疆烏魯木齊 830000；2.新疆五征綠色農業發展有限公司，新疆麥蓋提844600；3.新疆喀什地區畜牧工作站，新疆喀什844000)

多浪羊是新疆喀什地區主要的綿羊品種，具有體型大、生長速度快、肉產量高、屠宰性能良好等特點。多浪羊可以全年舍飼，能適應新疆南疆地區夏季干燥炎熱的環境，抗病力強，耐粗飼，能四季發情，且具有早熟性，是新疆優良的地方品種[1-3]。促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)能促進卵巢卵泡的生長、雌激素合成和分泌，促進卵泡顆粒細胞的增生和刺激卵泡細胞上促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)受體分化，其分泌方式受到下丘腦和性腺激素的調節，為脈沖式分泌。FSH控制顆粒細胞的發育、生長、成熟和類固醇生成，并在配子產生中發揮關鍵作用[4]。在發情周期的適宜時間給予適量的外源FSH[5]，可以有效地增加卵巢的排卵。FSH在綿羊生產上是常見的促超數排卵藥物。多浪羊一般一胎產一只羔羊，平均產羔率約為107%，繁殖率較低，制約規模化養殖場的經濟效益。利用外源激素對多浪羊實施同期發情處理和高效繁殖，可以提高繁殖效率，降低生產成本，增加養殖效益。

前人研究表明，孕酮+PMSG+PG的同期發情方法，可以達到很好的發情效果；較小劑量的FSH可以刺激少量卵泡同時發育排卵，產較多數量的羔羊。FSH多用于綿羊超數排卵，而利用FSH不同注射方式提高多浪羊的繁殖效率的相關報道較少。該研究以多浪羊為試驗羊，在同期發情處理過程中注射150 IU的FSH，觀察不同的注射方法對激素水平及發情的影響。為進一步提高多浪羊繁殖效率提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥品和器材。羊用孕酮海綿栓，新西蘭 Inter Greaulane 公司生產；注射用促卵泡素(規格為500 IU/支)、孕馬血清促性腺激素(規格為1 000 IU/支)、氯前列醇鈉(規格為0.2 mg/支)均由寧波市三生藥業有限公司生產。多功能酶標儀；美國Thereto Scientific公司；(FSH、LH、E2、P4)ELISA分析測定試劑盒；購自Groundwork Biotechnology Diagnosticate公司；生理鹽水、乙醇、碘酒、高錳酸鉀粉、青霉素、鏈霉素、假陰道、集精杯、開膣器、輸精槍、顯微鏡、恒溫水浴鍋等均為國產。

1.1.2試驗羊。 2020年5月在新疆五征綠色農業發展有限公司開展試驗。母羊為2歲左右(172只)；種公羊為2歲以上，性欲旺盛，體型、外貌良好的成年公羊2只；試情羊選用有配種史、性欲旺盛的公羊5只。

1.2 方法

1.2.1試驗羊分組與同期發情處理。采用單因素設計，選經過B超診斷未懷孕的試驗羊，設為A、B、C 3個試驗組和1個對照組D，在陰道中埋置1個孕酮海綿栓當天記為第 0 天，第9天A、B、C組按不同的FSH注射方法進行處理。A組10：00一次性注射FSH 150 IU；B組10：00注射100 IU FSH，8 h后再注射50 IU FSH；C組10：00注射75 IU FSH，8 h后再注射75 IU FSH；D對照組不注射FSH。4組第11天10：00撤栓時，肌肉分別注射PG 1 mL和PMSG 330 IU。

1.2.2發情鑒定。用試情公羊進行試情。在08：00和20：00，將試情公羊放到母羊圈各試情1次，以母羊站立不動并接受爬跨為發情標準，連續試情3 d，在72 h內發情視為同期處理有效，記錄每只羊從撤栓到發情的時間間隔。

1.2.3采精和人工授精。

(1)用假陰道法進行采精。種公羊精液采出后，先通過肉眼觀察，為乳白有“云吞”狀的，在400×顯微鏡下對精液樣品進行觀察，活率在0.8以上，密度達到“密”級，無異常氣味，色澤乳白的精液可用于人工輸精。

(2)精液稀釋配制。稱取葡萄糖 3 g、檸檬酸鈉 1.4 g，分別加入10萬IU青霉素和鏈霉素，溶解于100 mL滅菌水中，用0.22 μm的濾膜過濾。

(3)精液稀釋。將稀釋液和精液降至室溫。稀釋時根據所需輸精量，先進行等倍稀釋，再加大稀釋倍數，該試驗稀釋倍數為4倍。

1.2.4人工授精。使用陰道開張器輸精，對有發情表現的母羊于發情后的12和24 h進行2次人工授精，使用開張器，將輸精器插入子宮頸口內0.5～1.0 cm輸入鮮精液0.1 mL。

1.2.5血樣采集。挑選發情的多浪羊母羊98只，其中A組25只，B組25只，C組25只，D組23只，每只母羊在注射FSH前、撤栓時、發情0 h和發情12 h 頸靜脈采集血樣 3 mL，室溫下靜置5～6 h，3 000 r/min 離心 15～20 min，分離上層血清移入1.5 mL 離心管中，放入-20 ℃儲存。

1.2.6激素測定。試驗母羊血清采用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)測定E2、FSH、LH和P4的濃度。根據ELISA試劑盒操作步驟測定，測定血清中 E2、FSH、LH和P4的含量，并以450 nm OD值為橫坐標，濃度為縱坐標繪制標準曲線，計算出數值。

1.2.7數據統計分析。應用 SPSS 20.0(SPSS、Inc、Chicago、IL、USA)對激素水平、發情率數據進行卡方檢驗。

2 結果與分析

2.1 FSH不同處理方法對同期發情的影響統計4個試驗組4個時間點的發情母羊數，并計算撤栓后12～72 h總體的同期發情率，結果見表 1。

表1 FSH不同處理方法對多浪羊同期發情的影響

由表1可知，A、B、C組注射FSH后的發情率分別為77.78%、80.65%、87.50%，D對照組發情率為80.36%，統計分析顯示，4個組之間發情率差異不顯著(P>0.05)；但C組發情率高于其他組。

2.2 FSH不同處理方法對外周血液中生殖激素的影響

2.2.1不同FSH處理方法多浪羊血清中FSH濃度的比較。由表2可知，在FSH處理前、撤栓前、發情0 h和發情12 h時，各試驗組之間血清中FSH的濃度差異不顯著(P>0.05)；B、C、D組FSH濃度在發情0 h都出現了峰值。

表2 不同FSH處理方法多浪羊血清中FSH濃度的比較

2.2.2不同FSH處理方法多浪羊血清中E2濃度的比較。

由表3可知，在FSH處理前各試驗組之間血液中E2的濃度沒有顯著差異，在撤栓前B、C組顯著高于A、D組，在發情0 h時，B、C組極顯著高于A、D組，同時D組極顯著高于A組(P<0.01)，在發情12 h時，B、C、D組E2濃度顯著高于A組(P<0.05)。

表3 不同FSH處理方法多浪羊血清中E2濃度的比較

2.2.3不同FSH處理方法多浪羊血清中LH濃度的比較。由表4可知，FSH處理前和發情12 h時，各試驗組之間血液中LH的濃度沒有差異，撤栓前D組顯著高于A、B、C組(P<0.05)，在發情0 h時，B組顯著高于A、C、D組(P<0.05)。

表4 不同FSH處理方法多浪羊血清中LH濃度的比較

2.2.4不同FSH處理方法多浪羊血清中P4濃度的比較。由表5可知，在FSH處理前、撤栓前、發情0 h和發情12 h時，各試驗組之間血液中P4的濃度差異不顯著；B、C、D組的P4濃度峰值都出現在發情0 h時。

表5 不同FSH處理方法多浪羊血清中P4濃度的比較

3 討論

3.1 FSH不同處理方法對外周血液中生殖激素的影響FSH作用靶細胞是卵泡顆粒細胞，FSH使其增生，同時激活FSH受體細胞導致雄激素的合成，而雄激素是雌激素合成的重要前置物質，因而FSH能夠提高雌激素的濃度。雌激素與FSH協同作用一方面增加顆粒細胞中LH受體的分化，另一方面又促進顆粒細胞對雌激素的合成，形成一種良性循環。一般自然條件下綿羊發情是由于血清中E2濃度升高、P4濃度降低引起。

在卵泡周期募集期間，一群小卵泡對促性腺激素變得敏感并依賴于促性腺激素繼續生長發育[6]。引起卵泡周期募集的主要激素是FSH，發情周期中卵泡波的數量與FSH峰值的數量完全一致，這說明FSH峰是卵泡波出現的先決條件，用抑制素降低FSH的濃度，可以阻礙卵泡募集并推遲下個卵泡波的出現[7]。更多的卵泡同時發育需要人為地提高FSH濃度，雖然也需要基礎水平的LH，但LH脈沖在募集中沒有作用[8]。張振漢等[9]在灘羊試驗中，對產單、雙羔的母羊進行分組，將LH、P4和E2進行分析比較，雙羔組母羊在生殖周期中LH、P4和E2均顯著高于單羔組，其中E2在發情當天處于高水平，隨后下降，這與該試驗B、C、D組結果一致；P4在發情當天開始有所上升，與該試驗得出的在發情當天上升后隨之下降有所不同；LH雙羔組峰值出現在發情當天，且極顯著高于單羔組，與該試驗結果一致。常璐等[10]關于多浪羊同期發情試驗的數據顯示，E2在發情當天出現峰值，與該試驗結果一致；P4、FSH和LH峰值出現在發情后12 h，與該試驗結果略有差異。

通過試驗結果可以看到，在使用FSH處理多浪羊之前采集的血清中FSH、E2、LH和P4的濃度在各試驗組之間差異不顯著，而E2在發情0 h時，B和C組極顯著高于A、D組(P<0.01)，D組極顯著高于A組。試驗除了FSH的處理方法不一樣，其他處理方式相同，試驗組之間出現差異，說明注射的150 IU FSH對多浪羊E2濃度在發情0 h時有影響，但在4個時間點都未觀察到FSH的濃度在試驗組與對照組之間有顯著差異，只在撤栓時A組高于其他3組，這與FSH的半衰期短有關，說明FSH不是直接對E2產生影響，而是作用于某一中間受體，可能是卵泡顆粒細胞，FSH使其增生，在PMSG和PG共同的作用下，造成B、C組與A、D組在發情0 h 時E2濃度的顯著差異。

A組與B、C、D組的E2和LH濃度相比，在一次性注射150 IU FSH后一直處在較低水平，可能是造成了負反饋調節，也可能是激素的峰值提前或后移未被檢測到。

3.2 生殖激素水平對發情率的影響將發情率和發情0 h時FSH、E2、LH和P4的濃度進行分析比較發現，E2在發情0 h時，B、C組極顯著高于A、D組，D組極顯著高于A組；LH在發情0 h，B組顯著高于A、C、D組；A、B、C組注射FSH后的發情率分別為77.78%、80.65%、87.50%，對照組D組發情率為80.36%，統計分析顯示，4個組之間發情率差異不顯著(P>0.05)，但C組發情率高于其他組。B、C組的E2濃度相近，但是發情率C組高于B組，發情后C組的LH和P4的濃度要低于B組，可能是LH和P4參與了發情的催動，抑制了卵泡波的持續發生。

4 結論

外源生殖激素FSH的注射會對血液中 E2和LH的濃度造成影響，且發情0 h時血液中E2的濃度與發情率呈正相關。在發情0 h時出現A、B、C、D組的FSH峰值以及B、C、D組的LH、E2峰值，FSH和LH峰值的出現，為排卵前現象。一次性注射150 IU FSH可能會造成發情前、發情時、發情后的 E2和LH分泌的抑制，從而影響發情，考慮在以后試驗中單次FSH注射劑量不超過150 IU。75 IU+75 IU平均注射法對發情率有較好的作用；100 IU+50 IU遞減注射法，在發情0 h 可以明顯提高血液中E2和LH的濃度。