冬蓀綠霉病病原鑒定及藥劑篩選

劉忠玄，王萬坤，吳 陽，黃 靜，王 晶，王 芳，馬 丁，康 超*

(1.貴州科學院貴州省生物研究所，貴州貴陽 550025；2.貴州科學院貴州省分析測試院，貴州貴陽 550002；3.銅仁職業技術學院，貴州銅仁 554300)

冬蓀(Phallusdongsun)，常寄生于枯竹根部，屬于鬼筆目(Phallales)鬼筆科(Phallaceae)鬼筆屬(Phallus)[1]，是一種營養豐富、味道鮮美、肉質松脆的食藥兩用的林下真菌。自然條件下，冬蓀單生或簇生于林下腐殖質層中，主要分布于貴州、四川、云南、廣東、安徽等地[2-4]。冬蓀子實體未開傘前呈球形或卵圓形，俗稱菌蕾或菌蛋，半埋土生，灰色至白色，野生菌蛋直徑5～7 cm，人工種植菌蛋可達20 cm，基部有白色或淺黃色菌索，后期表面有皺紋，有彈性，待菌蛋硬化成熟后，菌托層由上部裂開開傘，形成白色子實體。冬蓀富含鄰苯二甲酸二丁酯、多糖、紫蘇烯、異山梨醇、麥甾醇、甲基硫醇、氨基酸、糖醛酸聚糖等成分，提取物能抑制腐敗菌生長，可開發為短期的生物性防腐劑，子實體、菌柄和菌托具有一定的治風濕、活血祛瘀、鎮痛、抗氧化甚至抗癌的藥用活性[5-7]，適當的食用可增強免疫力、防病保健[8]，隨著食藥價值和資源開發利用研發不斷突破，冬蓀日益成為人們關注的珍稀食用菌焦點。

冬蓀是貴州省大方縣的地方特色，也是中國國家地理標志產品，更是貴州省最主要林下經濟產業之一。2015年前大方縣、織金縣及周邊已種植超過133.33 hm2[9]，至2016年達400 hm2，凈產量約60 t。十三五期間，貴州省規劃人工種植冬蓀約666.67 hm2，產量達5萬t[貴州省“十三五”食用菌產業發展規劃(2016—2020年)]。近年來，隨著貴州省農業產業結構調整以及脫貧攻堅和鄉村振興發展戰略，助推食用菌產業迅速發展，冬蓀種植規模不斷擴大，尤其是國家地理標志產品認證后，冬蓀產業在貴州形成裂變式發展，產品數量和質量不斷提升，相關的科研成果也不斷涌現，但國內外對冬蓀的研究集中于資源分類、組織分離、良種選育、栽培技術、農藥及重金屬殘留、生化藥理特性等方面[10-12]。冬蓀病蟲害研究極少，主要是其抗病蟲害能力較強，一是冬蓀子實體由菌蛋生長破殼形成，自身具備較好的物理防御系統；二是冬蓀特殊的氣味和分泌物能有效趨避部分病蟲害侵染，因此，關于冬蓀病蟲害的研究極少。

2020和2021年秋季，正直冬蓀收獲期，筆者所在課題組成員分別從貴州省畢節市大方、織金2個縣采集65份冬蓀菌蛋綠霉病樣本，并對5個種植基地(約20 hm2)進行初步調查，其發病率達9%，發病程度為輕度。經鑒定為絨毛木霉(T.tomentosum)引起的冬蓀新病害，嚴重制約當地冬蓀產業高質量發展，急需闡明該病害的病原學并提出科學的防控方案。然而，截至2020年末，中國農藥信息網(http：//www.chinapesticide.org.cn/)登記的食用菌可用農藥產品13個、有效成分6種，3種類型(植物生長調節劑、殺菌劑、殺蟲劑)，僅咪鮮胺錳鹽為殺菌劑[13]，但均未提及冬蓀病害，關于該病害的防治仍是空白，防治藥劑急需篩選論證。因此，明確冬蓀綠霉病病原種類、篩選具有針對性的高效殺菌劑并進行藥劑混配試驗，選出共毒系數較高的混配方案為生產實踐提供理論參考，對當地冬蓀綠霉病的防控和延緩病原抗藥性具有十分重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料2020和2021年秋季，從貴州省畢節市大方縣、織金縣采集冬蓀綠霉病菌蛋共65份，用無菌袋密封包裝帶回實驗室進行病害診斷、病原分離。

4種殺菌劑原藥分別為95%咪鮮胺錳鹽(常州天擇化工有限公司)、96%吡唑醚菌酯(湖北康寶泰精細化工有限公司)、96%苯醚甲環唑(常熟恒耀新材料有限公司)、95%唑菌酯(沈陽化工研究院有限公司)。

1.2 冬蓀綠霉病病原菌分離培養組織分離法：選擇輕、中度感病菌蛋樣品，以75%無水乙醇消毒10 s，再用1% NaClO消毒1 min，無菌水沖洗3次并用無菌濾紙吸干水分，切取病健交界處組織塊(0.5 cm ×0.5 cm ×0.5 cm)于PDA培養基中25 ℃黑暗培養3 d，挑取純凈的菌絲進一步純化，分離物保存于4 ℃的PDA斜面。

菌絲分離法：在超凈工作臺中用無菌針挑取中、重度感病菌蛋樣品表面病原菌菌絲尖端，置于PDA培養基中25 ℃黑暗培養3 d，進一步純化得到純分離物保存于4 ℃的PDA斜面。

觀察記錄PDA培養基上病原菌落形態、培養特征，顯微鏡下觀察分生孢子、產孢結構形態和大小并拍照。

1.3 病原物致病性驗證2021年10月，在大方縣2個冬蓀基地(105°41′45″E，27°10′16″N)，采用注射法將孢子懸浮液(106conidia/mL)接種至無癥狀的冬蓀菌蛋(直徑8～12 cm)表皮層，每個菌蛋2個接種點，各50 μL，從分離純化獲得培養特征相似的菌株15株中隨機選擇3個代表菌株(GZDS1101、GZDS1102、GZDS1103)進行接種，各10個重復，以10個無菌水接種為對照。

1.4 病原物分子鑒定參照擎科生物提供試劑盒[T5Direct PCR Kit(TSE011)(TsingKe，Beijing，China)]說明提取病原DNA，并參照各引物特性進行PCR擴增。3個致病代表菌株GZDS1101、GZDS1102、GZDS1103的ITS、tef1、rpb2基因片段分別采用引物：(ITS)ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)，(ITS)ITS4(5′-TCCGCTTATTGATATGC-3′)；(tef1)EF1-728F(5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′)，(tef1)TEF1LLErev(5′-AACTTGCAGGCAATGTGG-3′)[14]；(rpb2)fRPB2-5F(5′-GGAGGATACTTCATCATCAATGG-3′)，(rpb2)fRPB2-7cR(5′-CCCATGGCTTGCTTGCCCAT-3′)[15]。

PCR反應體系(50 μL)，DNA模板1 μL，引物1 μL，2 × T5Direct PCR Mix 25 μL，ddH2O補足50 μL。反應條件：94 ℃預熱5 min，94 ℃變性30 s，55～60 ℃(各引物不同)退火30 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃補平10 min，40個循環。PCR產物電泳檢測并純化后送至擎科生物上海分公司進行測序并用Chromas軟件分析序列，上傳至NCBI數據庫，通過BLAST同源比對，采用MEGA 5.0構建系統發育樹。

1.5 防治藥劑篩選采用菌絲生長速率法篩選藥劑[16]。以GZDS1101為供試病原菌，將4種原藥配制成母液再稀釋至少5個濃度梯度，按體積1∶9加入PDA并制成平板，取直徑5 mm菌餅接種于5個濃度的PDA帶毒平板中心，等量無菌水代替農藥作為對照，重復3次，28 ℃培養2～3 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，運用DPS 13.0系統計算各藥劑對絨毛木霉菌絲生長抑制回歸方程和EC50。

菌絲生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100%

將咪鮮胺錳和苯醚甲環唑進行組合配比，按質量濃度8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8混合并稀釋至試驗濃度進行測試，以單劑作為對照，以無菌水替代為空白對照，各重復3次，求得各配比的毒力回歸方程和EC50，再根據共毒系數法求得獨立指數、理論毒力指數、實際毒力指數和混合劑的共毒系數CTC，CTC>120為增效作用，80

實測藥劑毒力指數(ATI)=標準藥劑的EC50/供試藥劑的EC50×100%

混劑理論毒力指數(TTI)=(藥劑A毒力指數×Ax)+(藥劑B毒力指數×Bx)(Ax、Bx為藥劑A、B在混劑中的百分比)

共毒系數(CTC)=ATI/TTI×100%

2 結果與分析

2.1 冬蓀綠霉病病害癥狀該病害發生于冬蓀菌蛋上，成熟子實體未見發生。病害的早期，菌蛋表面出現不規則的、褐色至黑色斑點，呈水漬狀，病斑不斷擴大，2～3 d后產生白霉狀物(病原的菌絲體)，菌蛋表皮出現腐爛癥狀并軟化，灰白色的表皮變為明顯水漬狀，開裂，內部肉質層裸露，軟腐的表皮褶皺狀塌陷，白色菌絲轉色為綠色粉狀霉層(圖1b、c、d)，嗅之有悶人的芳香，無惡臭味，很快全蛋腐爛、干癟，中重度感病菌蛋將無法發育為成熟的子實體，影響冬蓀產量和質量，嚴重時甚至絕收。

2.2 致病性測定結果3個菌株接種3 d后，處理組均觀察到白霉狀菌絲，明顯的表皮軟腐癥狀與野外發病癥狀相一致，7 d后出現淺綠色菌落(圖1 h)，對照組無感病癥狀，再分離發病組病原與接種病原形態特征一致，完成柯赫氏法則驗證。

2.3 冬蓀綠霉病病原形態鑒定結果3個致病菌株在PDA平板上生長迅速，菌絲稀疏棉絮狀，白色，中心淺黃色，背面淺灰黃色；菌絲無隔；分生孢子梗從菌絲交錯生出，直立單生，具有明顯的頸部，多數向上彎曲，長(4.0-)4.2～5.6(-5.9)μm，最寬(2.9-)3.1～3.8(-4.3)μm，底部寬(1.7-)2.1～2.7(-3.1)μm(n=50，圖1f)；分生孢子光滑、寬橢圓形，大小為(2.7-)3～3.3(-3.6)× 2.2～2.7 μm(n=50，圖1g)，病原形態特征與絨毛木霉T.tomentosum一致[17-19]。

注：a.無癥狀的冬蓀子實體和菌蛋，b、c、d.感病菌蛋軟腐、綠霉和開裂癥狀，e.絨毛木霉在PDA平板生長5 d后菌落正面和背面，f.分生孢子梗結構，g.分生孢子，h.病原GZDS1101接種7 d后發病癥狀。Note：a.Asymptomatic mature fruit body and immature “egg” of stinkhorn,b，c，d.Symptoms of rot，green mold and cracking on immature “egg”，respectively，e.T.tomentosum on PDA medium 5 days(front and back)，f.Conidiophore，g.Conidia，h.Symptoms at seven days after inoculation，pathogenic bacteria GZDS1101 in the treatment(GZDS1101).圖1 冬蓀綠霉病Fig.1 Green mold of P.dongsun

2.4 冬蓀綠霉病病原分子鑒定結果根據NCBI-BLAST和系統發育樹分析，3個菌株為同種，ITS基因與T.tomentosum(KX343119.1、KX343120.1、KX343120.1等)、T.cerinum(KP009282.1、KP009288.1)2個種同源性>98%，與其他種同源性<97%(圖2)，初步確認為木霉屬Trichoderma；tef1和rpb2基因與T.tomentosum(CBS 120637，S23，S33，等;圖3、圖4)同源性均為99%～100%，與其他種<96%，種水平將3株病原鑒定為絨毛木霉T.tomentosum[14]。

圖2 基于rDNA-ITS序列的病原菌系統發育進化樹Fig.2 The phylogenetic tree of pathogens based on rDNA-ITS sequence

圖3 基于tef1序列的病原菌系統發育進化樹Fig.3 The phylogenetic tree of pathogens based on tef1 sequence

圖4 基于rpb2序列的病原菌系統發育進化樹Fig.4 The phylogenetic tree of pathogens based on rpb2 sequence

2.5 防治冬蓀綠霉病藥劑篩選結果4種供試藥劑對病原菌生長均有一定的抑制效果，但敏感性存在顯著差異(表1)。苯醚甲環唑抑菌作用最強，EC50為1.93 mg/L；其次是吡唑醚菌酯，EC50為4.02 mg/L，咪鮮胺錳鹽EC50為4.96 mg/L，而唑菌酯敏感性較低，EC50為23.89 mg/L。

表1 不同殺菌劑對病原菌絲生長抑制情況

選用咪鮮胺錳鹽(食用菌合法登記)與敏感性最強的苯醚甲環唑進行混配試驗，結果顯示不同比例混配抑菌效果差異顯著。咪鮮胺錳鹽與苯醚甲環唑的質量比為1∶2時CTC>120，為150.88，表現增效作用，增效顯著。質量比為1∶1和1∶4 時，CTC值分別為104.25和117.56，為相加作用，其他混配質量比的CTC值均<80，在試驗中表現一定的拮抗作用(表2)。

表2 咪鮮胺錳鹽與苯醚甲環唑混配抑菌效果

3 討論

該研究對采自貴州省大方和織金2縣的冬蓀綠霉病進行病原分離、致病性測定及鑒定發現，病原菌株具有較強的致病性，經形態和多基因分子生物學鑒定為絨毛木霉T.tomentosum。采用菌絲生長速率法測定4種殺菌劑原藥對病原菌的毒力，結果表明，病原菌對4種藥劑均有一定的敏感性，其中苯醚甲環唑抑菌作用最強，EC50為1.93 mg/L；其次是吡唑醚菌酯和咪鮮胺錳鹽也較敏感，EC50分別為4.02和4.96 mg/L，而唑菌酯敏感性相對較低，EC50為23.89 mg/L。咪鮮胺錳鹽與苯醚甲環唑混質量比為1∶2時，EC50為2.18 mg/L，CTC值為150.88，大于120，表現增效作用，在該試驗中抑菌效果最強，質量比為1∶1和1∶4時，為相加作用，其他混配質量比表現一定的拮抗作用。

目前，關于冬蓀的研究主要在中國，并集中在種源選育、栽培技術和產品加工等方面，關于病害的研究極少，隨著貴州地區規模化種植及食用菌連作障礙的影響，冬蓀病害日益嚴重，該研究的冬蓀綠霉病一般在低海拔(800 m以下)區域的高溫天氣(28 ℃以上)大發生，傳播速度較快，具有較強的傳染性，尤其是蚊蟲叮咬或受傷的冬蓀菌蛋上發病率更高，傷口有助于病原菌入侵定殖，該病害已成為制約該地區冬蓀產業發展的重要因素之一，該研究鑒定冬蓀綠霉病病原為絨毛木霉，該菌在有益和有害菌方面均少有記載，急需科學的防控策略和方法。

在藥劑篩選試驗中，僅咪鮮胺錳鹽為已登記的食用菌可用藥，在供試藥劑中單劑藥效中等；而苯醚甲環唑單劑作用效果最佳，將二者進行混配測試，結果顯示二者并不是簡單的相加增效作用，當咪：苯為1∶2時增效最顯著，不合適的混配甚至出現一定的拮抗作用，通過藥劑混配，不僅能提升協同增效殺菌譜，還能延緩病原菌抗藥性產生，提升藥劑適用期限。藥劑篩選結果表明，4種供試藥劑對病原菌均有較強的抑制作用，該結果可為冬蓀綠霉病的田間藥劑防治提供一定的理論依據。