江南山梗菜中1個新的三萜類化合物及其生物活性研究

邱玨琳，陳俊磊，魏英煥，王朝陽，李歡陽，付 茂，苑春茂，黃烈軍，郝小江, 4*，顧 瑋*

?化學成分 ?

江南山梗菜中1個新的三萜類化合物及其生物活性研究

邱玨琳1, 2, 3，陳俊磊1, 2，魏英煥1, 2，王朝陽1, 2，李歡陽1, 2，付 茂1, 2，苑春茂1, 2，黃烈軍1, 2，郝小江1, 2, 4*，顧 瑋1, 2*

1. 貴州醫科大學 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550014 2. 貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550014 3. 貴州醫科大學藥學院，貴州 貴陽 550025 4. 中國科學院昆明植物研究所，云南 昆明 650201

對江南山梗菜中的三萜類成分及其生物活性進行研究。采用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20及HPLC等色譜技術進行分離純化，運用NMR、MS等波譜技術進行化合物的結構鑒定。采用四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT] 法篩選分離得到化合物對人非小細胞肺癌A549細胞的細胞毒性；采用4-硝基苯基-α-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α--glucopyranoside，PNPG）法測定分離得到化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。從江南山梗菜的醋酸乙酯部位中分離得到6個三萜類化合物，分別鑒定為3β-正十六酸酯-齊墩果烷-12-烯-11-酮（1）、熊果酸（2）、齊墩果酸（3）、sumaresinolic acid（4）、3β-羥基-齊墩果烷-12-烯-11-酮（5）、32,33,34-三甲基-細菌藿烷-16-烯-3-β-吡喃葡萄糖苷（6）。細胞毒活性篩選結果表明，化合物1和5對A549細胞增殖有顯著的抑制活性，其半數抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）分別為（26.72±2.05）、（36.70±3.43）μmol/L。α葡萄糖苷酶抑制活性篩選結果表明，化合物2和3對α-葡萄糖苷酶有較強的抑制活性，其IC50分別為（28.97±1.73）、（11.87±1.18）μmol/L，抑制活性均高于陽性藥阿卡波糖；化合物1對α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50為（148.47±2.09）μmol/L，抑制活性與陽性藥阿卡波糖相當。化合物1為新化合物，命名為山梗菜萜A；化合物2～6均為首次從江南山梗菜中分離得到。化合物1和化合物5對A549細胞有較強的細胞毒活性。化合物1～3對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制活性。

江南山梗菜；三萜；山梗菜萜A；細胞毒活性；α-葡萄糖苷酶抑制活性；熊果酸；齊墩果酸；3β-羥基-齊墩果烷-12-烯-11-酮

江南山梗菜Franch.為桔梗科（Campanulaceae）半邊蓮屬L.多年生草本植物，又名大種半邊蓮、節節花、江南大將軍、大半邊蓮、江南苦菜。該植物生于海拔2300 m以下的山地林邊或溝邊較陰濕處，主要分布在我國貴州、福建、江西、浙江、安徽等南方各地[1]。臨床上主要用于治療癰腫疔瘡、蛇蟲咬傷、骨結核、胃寒痛[2]。江南山梗菜作為一種重要的中藥資源，目前國內外對于江南山梗菜的化學成分及其生物活性的研究報道較少，張明哲等[3]從中分離得到8個化合物，分別為三萜類、生物堿類及甾醇類，且并未對其活性成分做進一步研究。因此對其化學成分和生物活性進行系統的研究，可以更深入地闡明該植物的藥效物質基礎，為該藥用植物的開發應用提供科學依據。本實驗對江南山梗菜全草的乙醇提取物中的化學成分進行深入研究，共分離得到6個三萜類化合物，分別鑒定為3β-正十六酸酯-齊墩果烷-12-烯-11-酮（3β-hexadecanoate-olean-12-en-11-one，1）、熊果酸（ursolic acid，2）、齊墩果酸（oleanic acid，3）、sumaresinolic acid （4）、3β-羥基-齊墩果烷-12-烯-11-酮（3β-hydroxy-olean-12-en-11-one，5）、32,33,34-三甲基-細菌藿烷-16-烯-3-β-吡喃葡萄糖苷（32,33,34-trimethyl-bacteriohopan-16-ene-3-β-glucopyranoside，6）。其中化合物1為新化合物，命名為山梗菜萜A；化合物2～6均為首次從江南山梗菜中分離得到。進一步采用MTT法測定分離得到化合物對人非小細胞肺癌A549細胞的細胞毒活性；采用PNPG法測定分離得到化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

1 儀器與材料

UV-2401PC紫外光譜儀（日本島津公司）；Autopol VI自動旋光儀（美國魯道夫公司）；Bruker Avance NEO 600MHz超導核磁共振儀（德國Bruker公司）；HITACHI高效液相色譜儀Primaide（日本日立公司）；Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（半制備柱，250 mm×9.4 mm，5 μm，美國安捷倫公司）；QE Focus型串聯四極桿飛行時間液質譜聯用儀（賽默飛世爾科技有限公司）；EYELA-1100型旋轉蒸發儀（日本東京理化器械株式會社）；BioTek Epoch全波長酶標儀（美國BioTek公司）；40～80目和200～300目柱色譜硅膠（青島海洋化工廠）；反相填充材料RP-C18（25～40 μm，德國默克公司）；Sephadex LH-20凝膠（瑞典Pharmacia公司）；甲醇、石油醚、三氯甲烷、醋酸乙酯等試劑購買于天津市富宇精細化工有限公司；色譜甲醇（上海星可高純溶劑有限公司）；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）和四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-dimethyl-2- thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]，上海麥克林生化科技有限公司；4-硝基苯基-α-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α--glucopyranoside，PNPG）和α-葡萄糖苷酶（美國Sigma Chemical公司）；A549細胞來源于美國模式培養物集訓庫（American type culture collection，ATCC）；阿卡波糖（上海畢得醫藥公司，批號BD111950）；順鉑（上海源葉生物科技有限公司，批號B24462）。

江南山梗菜全草2020年9月采自貴州省畢節市，經貴州省中國科學院天然產物重點實驗室顧瑋副研究員鑒定為江南山梗菜Franch.，憑證標本（GZCNG-2020-0047）存放于貴州省中國科學院天然產物重點實驗室。

2 提取與分離

江南山梗菜全草（30 kg）粉碎后用75%乙醇回流提取3次，每次3 h，濾過，合并提取液，減壓濃縮后將浸膏（6.1 kg）分散于水中，依次用醋酸乙酯、正丁醇萃取。將各個部位萃取液濃縮，得到醋酸乙酯部位（1.0 kg），正丁醇部位（760.3 g）。醋酸乙酯部位首先通過正相硅膠柱色譜（40～80目），分別以石油醚-醋酸乙酯（20∶1～2∶1）、三氯甲烷-甲醇（100∶0～1∶1）梯度洗脫，并分段收集，通過薄層色譜（TCL）檢測分析，合并得到9個組分Fr. 1～9。Fr. 1（31.1 g）經硅膠色譜[石油醚-醋酸乙酯（100∶0～1∶50）] 洗脫得到5個亞流分（Fr. 1-1～1-5）。Fr. 1-3（5.9 g）經過凝膠柱色譜[三氯甲烷-甲醇（1∶1）] 純化后重結晶得到化合物1（1.1 g）。Fr. 1-5（18.7 g）反復用硅膠柱色譜[三氯甲烷-甲醇（15∶1）] 純化后經過Sephadex LH-20凝膠柱色譜[三氯甲烷-甲醇（1∶1）] 分離得到化合物3（1.5 g）。Fr. 4（76.4 g）首先經過RP-C18柱色譜，以水-甲醇（60∶40～0∶100）梯度洗脫得到7個亞流分（Fr. 4-1～4-7）。Fr. 4-1（6.5 g）經硅膠色譜柱[氯仿-甲醇（10∶1～1∶1）] 梯度洗脫得到5個次流分（Fr. 4-1-1～4-1-5）。Fr. 4-1-3（1.3 g）經過Sephadex LH-20凝膠柱色譜[三氯甲烷-甲醇（1∶1）] 純化再經半制備型HPLC [甲醇-水（43∶57），2 mL/min] 純化得到化合物5（11.0 mg，R＝37.5 min）。Fr. 4-3（6.4 g）經硅膠色譜柱色譜[氯仿-甲醇（20∶1～2∶1）] 梯度洗脫得到化合物2（3.9 g）。Fr. 4-6（6.4 g）用硅膠柱色譜，依次用石油醚-醋酸乙酯（10∶1）、三氯甲烷-甲醇（15∶1）梯度洗脫得到8個次流分（Fr. 4-6-1～4-6-8）。Fr. 4-6-2（1.4 g）經過Sephadex LH-20凝膠柱色譜[三氯甲烷-甲醇（1∶1）] 分離得到化合物4（20.0 mg），Fr. 4-6-3（1.4 g）經過Sephadex LH-20凝膠柱色譜[三氯甲烷-甲醇（1∶1）] 分離得到化合物6（32.0 mg）

3 結構鑒定

表1 化合物1的核磁共振波譜數據 (600/150 MHz, CDCl3)

圖1 化合物1的結構、主要1H-1H COSY (―) 和HMBC (→) 相關

化合物2：白色粉末，分子式C30H48O3；ESI-MS/479 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 5.13 (1H, dd,= 6.8, 3.2 Hz, H-12), 3.00 (1H, m, H-3), 2.11 (1H, d,= 11.3 Hz, H-18), 1.93 (2H, dd,= 13.4, 4.2 Hz, H-11), 1.59 (1H, dt,= 6.4, 3.2 Hz, H-9), 1.57 (2H, m, H-1), 1.54 (2H, m, H-22), 1.54 (2H, m, H-16), 1.49 (1H, m, H-20), 1.46 (1H, m, H-6a), 1.42 (2H, m, H-2), 1.31 (1H, m, H-19), 1.29 (1H, m, H-6b), 1.29 (2H, m, H-21), 1.26 (2H, m, H-7), 1.05 (3H, s, H-27), 1.01 (2H, m, H-15), 0.92 (3H, s, H-30), 0.90 (3H, s, H-23), 0.87 (3H, s, H-25), 0.82 (3H, d,= 6.5 Hz, H-29), 0.75 (3H, s, H-26), 0.68 (3H, s, H-24), 0.66 (1H, s, H-5)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 178.8 (C-28), 138.7 (C-13), 125.0 (C-12), 77.3 (C-3), 55.2 (C-5), 52.8 (C-18), 47.3 (C-9), 47.3 (C-16), 42.1 (C-14), 39.6 (C-8), 39.0 (C-20), 38.9 (C-19), 38.8 (C-4), 38.7 (C-1), 37.0 (C-10), 36.80 (C-22), 32.2 (C-15), 30.7 (C-7), 28.7 (C-23), 28.0 (C-21), 27.4 (C-2), 24.3 (C-11), 23.7 (C-27), 23.3 (C-16), 21.6 (C-30), 18.5 (C-6), 17.5 (C-29), 17.4 (C-24), 16.5 (C-25), 15.7 (C-26)。以上數據與文獻報道一致[5]，故鑒定化合物2為熊果酸。

化合物3：白色粉末，分子式C30H48O3；ESI-MS/479 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 5.16 (1H, m, H-12), 1.19 (3H, s, H-27), 0.89 (3H, s, H-26), 0.85 (9H, s, H-23, 25, 30), 0.72 (3H, s, H-29), 0.68 (3H, s, H-24)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 179.1 (C-28), 144.3 (C-13), 122.0 (C-12), 77.3 (C-3), 55.2 (C-5), 47.5 (C-9), 46.1 (C-19), 45.9 (C-17), 41.8 (C-14), 41.2 (C-18), 40.4 (C-8), 39.3 (C-8), 38.8 (C-4), 38.5 (C-1), 37.0 (C-10), 33.8 (C-21), 33.3 (C-29), 32.9 (C-7), 32.5 (C-22), 30.9 (C-20), 28.6 (C-23), 27.6 (C-15), 27.4 (C-2), 26.0 (C-27), 23.8 (C-30), 23.4 (C-11), 23.0 (C-16), 18.5 (C-6), 17.3 (C-26), 16.5 (C-24), 15.6 (C-25)。以上數據與文獻報道一致[6]，故鑒定化合物3為齊墩果酸。

化合物4：白色粉末，分子式 C30H48O4；ESI-MS/471 [M－H]?。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 5.34 (1H, t,= 3.2 Hz, H-12), 4.56 (1H, s, H-6), 3.18 (1H, dd,= 10.6, 5.4 Hz, H-3), 1.32 (3H, s, H-26), 1.20 (3H, s, H-25), 1.12 (3H, s, H-24), 1.09 (3H, s, H-23), 1.09 (3H, s, H-27), 0.94 (3H, s, H-29), 0.92 (3H, H-30)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 184.0 (C-28), 142.8 (C-13), 122.8 (C-12), 79.1 (C-3), 68.6 (C-6), 55.7 (C-5), 47.9 (C-9), 46.5 (C-17), 45.9 (C-19), 42.2 (C-14), 40.9 (C-18), 40.5 (C-7), 40.3 (C-1), 39.5 (C-4), 38.4 (C-8), 36.5 (C-10), 33.9 (C-21), 33.1 (C-29), 32.3 (C-22), 30.7 (C-20), 27.6 (C-15), 27.9 (C-23), 27.3 (C-2), 26.0 (C-27), 23.3 (C-11), 23.0 (C-16), 23.6 (C-30), 18.2 (C-26), 17.1 (C-24), 17.0 (C-25)。以上數據與文獻報道一致[7]，故鑒定化合物4為sumaresinolic acid。

化合物5：白色粉末，分子式 C30H48O2；ESI-MS/439 [M－H]?。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6):5.60 (1H, s, H-12), 3.24 (1H, dd,= 11.4, 4.8 Hz, H-3), 2.34 (1H, s, H-9), 2.13 (1H, d,= 13.6, 3.6 Hz, H-18), 1.83 (1H, m, H-2), 1.67 (3H, m, H-26), 1.37 (3H, m, H-27), 1.01 (3H, s, H-28), 0.91 (3H, s, H-30), 0.70 (1H, m, H-5)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 200.4 (C-11), 170.7 (C-13), 128.1 (C-12), 78.8 (C-3), 61.8 (C-9), 54.9 (C-5), 47.6 (C-18), 45.4 (C-14), 45.2 (C-19), 43.4 (C-8), 39.2 (C-4), 37.1 (C-10), 36.5 (C-22), 34.4 (C-21), 33.1 (C-29), 32.8 (C-7), 32.4 (C-17), 31.1 (C-20), 28.8 (C-23), 27.3 (C-16), 26.5 (C-2), 26.4 (C-15), 23.5 (C-27), 18.7 (C-26), 17.5 (C-6), 16.4 (C-24), 15.6 (C-15)。以上數據與文獻報道一致[8]，故鑒定化合物5為3β羥基-齊墩果烷-12-烯-11-酮。

化合物6：白色粉末，分子式 C44H76O6；ESI-MS/723 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 5.32 (1H, s, H-16), 4.92 (2H, m, H-6′), 4.21 (1H, d,= 7.7 Hz, H-4′), 3.13 (1H, m, H-2′), 3.08 (1H, m, H-5′), 1.94 (2H, m, H-2), 1.15 (3H, m, H-29), 0.99 (1H, m, H-21), 0.64 (3H, m, H-33)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6):140.9 (C-17), 121.7 (C-16), 101.2 (C-1′), 77.4 (C-3), 77.2 (C-3′), 77.1 (C-2′), 73.9 (C-5′), 70.6 (C-4′), 61.5 (C-5′), 56.6 (C-21), 55.9 (C-5), 51.0 (C-13), 50.1 (C-13), 45.6 (C-4), 42.3 (C-14), 42.2 (C-18), 40.3 (C-10), 39.4 (C-20), 38.7 (C-23), 37.3 (C-19), 36.7 (C-2), 35.9 (C-22), 33.8 (C-15), 31.9 (C-2), 29.7 (C-20), 29.2 (C-23), 28.3 (C-15), 25.9 (C-34), 24.3 (C-12), 23.1 (C-31), 23.1 (C-32), 21.6 (C-11), 21.4 (C-33), 21.1 (C-29), 20.2 (C-26), 19.6 (C-27), 19.4 (C-25), 19.3 (C-24), 19.1 (C-28), 12.6 (C-32), 12.3 (C-34), 12.3 (C-33), 12.1 (C-35)。以上數據與文獻報道一致[9]，故鑒定化合6為32,33,34-三甲基-細菌藿烷-16-烯-3-β吡喃葡萄糖苷。

4 生物活性評價

4.1 對A549細胞的細胞毒性實驗

采用MTT法對分離鑒定的6個化合物進行A549細胞的細胞毒性測定，以順鉑為陽性藥，具體的細胞毒活性實驗操作流程和操作方法參考本課題組前期研究報道[10]。

結果顯示，化合物1對A549細胞增殖有顯著的抑制活性，其半數抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）為（26.72±2.05）μmol/L，化合物5對A549細胞增殖同樣有顯著的抑制活性，其IC50為（36.70±3.43）μmol/L。與陽性對照順鉑[IC50為（11.71±0.85）μmol/L]相比，對A549細胞增殖的抑制活性均稍低于陽性藥。其余化合物對A549細胞增殖的抑制活性較弱，在初篩200 μmol/L濃度下，抑制率均低于50%，具體活性評價結果數據見表2。

4.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

采用PNPG法對分離鑒定的6個化合物進行體外α葡萄糖苷酶抑制活性測定，以阿卡波糖為陽性對照藥物，具體的抑制活性實驗操作流程和操作方法見本課題組前期研究報道[11-12]。

表2 化合物1～6對A549細胞、α-葡萄糖苷酶的IC50()

a-順鉑 b-阿卡波糖

a-cisplatin b-acarbose

實驗結果顯示，發現有3個化合物具有顯著的α-葡萄糖苷酶抑制活性，具體活性評價結果數據見表2。化合物1的IC50值為（148.47±2.09）μmol/L，抑制活性約為陽性對照阿卡波糖的1.68倍，化合物2的IC50值為（28.97±1.73）μmol/L，抑制活性約為陽性對照阿卡波糖的8.61倍，化合物3的IC50值為（11.87±1.18）μmol/L，抑制活性約為陽性對照阿卡波糖的21.02倍。

5 討論

本實驗運用多種色譜分離方法和波譜鑒定技術從江南山梗菜醋酸乙酯部位分離鑒定了6個三萜類化合物（1～6），其中化合物1為新化合物，命名為山梗菜萜A；化合物2～6均為首次從江南山梗菜中分離得到。A549細胞的細胞毒性實驗表明，化合物1和化合物5對A549細胞增殖有較強的抑制活性。α-葡萄糖苷酶抑制活性測定表明，化合物1對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制活性，其活性與陽性藥阿卡波糖相當；化合物2（熊果酸）和3（齊墩果酸）對α-葡萄糖苷酶表現出較強的抑制活性，熊果酸和齊墩果酸是很多植物體內的常見成分，關于二者的降糖作用前人已有報道。李明等[13]構建2型糖尿病模型觀察了熊果酸對2型糖尿病大鼠血糖的影響，發現熊果酸高、中劑量組對2型糖尿病大鼠空腹血糖有明顯降低作用且與模型組差異顯著。宋志成等[14]用PNPG法對齊墩果酸極其衍生物的α-葡萄糖苷酶抑制活性進行了篩選，發現齊墩果酸表現出顯著的α-葡萄糖苷酶體外抑制活性。本研究結果進一步印證了2種三萜化合物的降糖活性。可以為未來開發該類化合物的降糖藥物提供一定的啟示。綜上，本實驗從江南山梗菜中得到1個新的三萜類化合物，并印證了江南山梗菜化學成分的抗腫瘤活性和降糖活性，為發現潛在的抗癌活性成分和降糖活性成分提供參考，也為江南山梗菜資源的進一步開發和利用奠定了基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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A new triterpenoids and biological activities from

QIU Jue-lin1, 2, 3, CHEN Jun-lei1, 2, WEN Ying-huan1, 2, WANG Zhao-yang1, 2, LI Huan-yang1, 2, FU Mao1, 2, YUAN Chun-mao1, 2, HUANG Lie-jun1, 2, HAO Xiao-jiang1, 2, 4, GU Wei1, 2

1. State Key Laboratory of Functions and Applications of Medicinal Plants, Guizhou Medical University ,Guiyang 550014, China 2. The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences, Guiyang 550014, China 3. Pharmacy of Guizhou Medical University, Guiyang 550025, China 4. Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China

To study the chemical constituents and biological activities of triterpenoids from.The chemical constituents were isolated and purified by silica gel, Sephadex LH-20 and HPLC. The chemical structures were identified by the spectroscopic methods (NMR and MS). The cytotoxic activities to the human non-small-cell lung cancer A549 cells of the compounds were determined by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay. Moreover, the α-glycosidase inhibitory activity of the compounds were determined by 4-nitrophenyl-α--glucopyranoside (PNPG) assay.Six triterpenoids were isolated from.and identified as 3β-hexadecanoate-olean-12-en-11-one (1), ursolic acid (2), oleanic acid (3), sumaresinolic acid (4), 3β-hydroxy-olean-12-en-11-one (5), and 32,33,34-trimethyl-bacteriohopan-16-ene 3-β- glucopyranoside (6). The screening results showed that compounds 1 and 5 had strong inhibitory activity for the A549 cells with the IC50value of (26.72±2.05) μmol/L and (36.70±3.43) μmol/L. While compounds 2 and 3 had strong inhibitory activities against α-glycosidase with the IC50values of (28.97±1.73) and (11.87±1.18) μmol/L, respectively, which were higher than that of acarbose, and compound 1 exhibted moderate inhibitory activities against α-glycosidase with the IC50value of (148.47±2.09) μmol/L, which was similar to acarbose.Compound 1 is a new compound named davidioterpene A. Compounds 2?6 are isolated fromfor the first time. Compounds 2 and 5 have strong inhibitory activity against A549 cells. Compounds 1?3 are found to have definite α-glycosidase inhibitory activity.

Franch.; triterpenoids; davidioterpene A; cytotoxic activity; α-glycosidase inhibitory; ursolic acid; oleanic acid; 3β-hydroxy-olean-12-en-11-one

R284.1

A

0253 - 2670(2023)06 - 1713 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.002

2023-01-10

國家自然科學基金項目（32060081）；國家自然科學基金項目（31860074）；國家自然科學基金項目（U1812403）；貴州醫科大學學術新苗項目（19NSP003）

邱玨琳，女，碩士，研究方向為天然藥物化學。E-mail: 1214316595@qq.com

顧 瑋，女，博士，副研究員，研究方向為民族藥物化學。Tel: (0851)63804492 E-mail: guwei@mail.kib.ac.cn

郝小江，男，博士，研究員，研究方向為化學生物學。Tel: (0851)63804492 E-mail: haoxj@mail.kib.ac.cn

[責任編輯 王文倩]