基于網絡藥理學和分子對接探討鴉膽子治療結直腸癌的作用機制

趙韋欣，王 晴，王夢齊，季安璇，鄭晶瑩，趙淑華

基于網絡藥理學和分子對接探討鴉膽子治療結直腸癌的作用機制

趙韋欣，王 晴，王夢齊，季安璇，鄭晶瑩*，趙淑華*

吉林大學第二醫院 婦產科，吉林 長春 130022

采用網絡藥理學結合分子對接及體內驗證，探究鴉膽子治療結直腸癌的活性成分、關鍵作用靶點及潛在的分子機制。從公共數據庫中檢索并收集鴉膽子的活性成分和對應的靶點以及結直腸癌相關的靶點，通過網絡藥理學分析出鴉膽子治療結直腸癌的活性成分、成分-疾病的交集靶點以及可能的信號通路。通過分子對接預測活性成分與靶點蛋白的結合能力。通過體內實驗進一步驗證鴉膽子活性成分治療結直腸癌的作用和作用機制。在滿足篩選條件的15個成分中共篩出鴉膽子苦醇、木犀草素、鴉膽子苷B、β-谷甾醇4個鴉膽子生物活性成分及32個鴉膽子治療結直腸癌的作用靶點，表皮因子生長受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）及細胞周期蛋白D1（cyclin D1）是鴉膽子治療結直腸癌的關鍵靶點，EGFR/磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路可能在鴉膽子治療結直腸癌中發揮重要作用。分子對接結果表示4個生物活性成分均可較好結合，其中鴉膽子苦醇與3個關鍵靶點的平均結合能負值最大，結合最穩定，可能是鴉膽子抗結直腸癌最有效的活性成分。動物實驗結果表明，與對照組比較，鴉膽子苦醇明顯抑制裸鼠體內移植瘤的體積和質量（＜0.01），下調腫瘤組織中EGFR、PI3K和Akt的蛋白表達水平（＜0.01），下調與G1/G0期細胞阻滯相關的cyclin D1和細胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）的表達（＜0.01），上調與腫瘤細胞凋亡相關的cleaved Caspase-3表達及B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）/B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）值（＜0.01），下調與遷移和侵襲相關的蛋白基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、MMP7表達（＜0.01）；鴉膽子苦醇組裸鼠肝功能、腎功能及血液指標均未見顯著性差異。鴉膽子能夠通過多靶點、多通路治療結直腸癌，其主要活性成分為鴉膽子苦醇，其機制可能與抑制EGFR/PI3K/Akt信號通路從而引起G1/G0期阻滯，抑制增殖、侵襲和遷移，促進細胞凋亡有關。

鴉膽子；鴉膽子苦醇；結直腸癌；網絡藥理學；分子對接；木犀草素；鴉膽子苷B；β-谷甾醇；表皮因子生長受體；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；細胞周期蛋白D1

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化系統常見的惡性腫瘤之一，是全球癌癥死亡率的第2大原因[1]。大多數CRC是散發的，遺傳及環境因素是其重要的致病因素[2]。化療是CRC的關鍵治療方案之一[3]。傳統中藥制劑作為癌癥化療的輔助治療已經在全世界范圍內被廣泛接受[4]。大量研究及臨床實踐向腫瘤的綜合治療不斷拓展，已經證明傳統中藥作為輔助療法，與化療或者放療相結合，可以提高療效、減少不良反應[5-7]。

鴉膽子(L.) Merr.是原生于我國東南部及其他熱帶、亞熱帶地區的苦木科灌木。以鴉膽子果實為原料生產的中藥抗腫瘤注射液，已廣泛在臨床被用于肺癌、肺癌腦轉移和胃腸道腫瘤的輔助治療。臨床研究證明鴉膽子可以增強臨床上晚期非小細胞肺癌的療效并降低化療的不良反應[8-9]。鴉膽子苦醇是鴉膽子的重要活性成分[10]。研究發現，鴉膽子苦醇對乳腺癌、鼻咽癌、肺癌和其他惡性腫瘤均有抑制作用[11-14]。鴉膽子果實的乙醇提取物可能通過上調p53和抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抗人結腸癌HCT116細胞生長[15]。然而，其潛在機制尚不清楚。

網絡藥理學是一種結合計算機科學與醫學來闡述藥物對疾病作用機制的新興方法，能系統地研究、鑒定中藥配方的生物活性化合物并可視化其多靶點、多途徑的作用機制，已被廣泛應用于預測、分析中藥的藥理作用及潛在機制[4,16-17]。因此，本研究從網絡藥理學角度篩選鴉膽子的活性成分及針對CRC的靶點和信號通路。分子對接是研究小分子藥物與靶點蛋白受體之間的相互作用及親和力的模擬計算方法。分子對接可以作為網絡藥理學的進一步驗證，二者互補地用于中藥研究[18]。本研究通過分子對接模擬鴉膽子已鑒定組分與其可能靶標蛋白的分子相互作用并計算結合力。鴉膽子苦醇作為被驗證的鴉膽子抗腫瘤活性成分[10]，本研究進一步在裸鼠荷瘤模型中驗證其抗CRC的潛力及網絡藥理學預測的效應機制。

1 材料

1.1 動物

12只SPF級雌性BALB/c-Nu小鼠，6周齡，體質量16～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，質量合格證編號No.110322220103372262，質量許可證號SCXK（京）2019-0008，動物使用許可證號SYXK（吉）2018-0001。動物于相對濕度45%～55%、溫度（22±1）℃、12 h光暗循環的環境下，適應性飼養1周，自由進食飲水。動物實驗經吉林大學基礎學院倫理委員會批準（批準號202073）。

1.2 細胞

HCT116細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.3 藥品與試劑

鴉膽子苦醇（批號B26016，質量分數≥98%）、β-環糊精（批號T66291）購自上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號D8418）購自美國Sigma公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號P0006C）購自上海碧云天生物技術有限公司；4%～15%連續梯度聚丙烯酰胺預制膠（批號DG101-01）購自北京全式金生物技術股份有限公司；表皮因子生長受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抗體（批號AF6043）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抗體（批號AF6241）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體（批號AF6261）、細胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）抗體（批號DF6102）、細胞周期蛋白B1（cyclin B1）抗體（批號AF6168）、cyclin D1抗體（批號AF0931）、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）抗體（批號AF7022）、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號AF6139）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號AF0120）、蛋白基質金屬蛋白酶7（matrix metalloproteinase 7，MMP7）抗體（批號AF0218）、MMP2抗體（批號AF5330）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號AF7021）、電化學發光試劑盒（批號KF001）均購自江蘇親科生物研究中心有限公司；HRP標記的羊抗兔二抗（批號SA00001-2）購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.4 儀器

ChemiScope 6000 Touch型凝膠成像儀（上海勤翔科學儀器有限公司）；SC-412型4 ℃立式冷藏柜（青島市海爾股份有限公司）；PowerPac3000型電泳儀（美國Bio-Rad公司）；MOV-112F型細胞培養箱（日本三洋公司）；V18R型高速冷凍離心機（瑞士Dynamica公司）；BETS-100型搖床振蕩器（海門市其林貝爾公司）；Hemo 3600V型Shinova血液學分析儀（上海麥本醫療科技有限公司）。

2 方法

2.1 鴉膽子的網絡藥理學分析及分子對接

2.1.1 鴉膽子的活性成分及靶點 利用中醫系統藥理學數據庫（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp. php）、中醫藥資料庫（http://tcm.cmu.edu.tw/）以及文獻檢索的方法收集鴉膽子的主要活性成分，將能在PubChem中檢索對應的CAS號和SMILES號的成分進行收集。同時，對收集的成分進行藥動學信息檢索，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為篩選條件。

2.1.2 CRC的靶點及交集靶點的獲取 在GeneCards（https://www.genecards.org）中，以“CRC”為檢索詞，物種限定為“Homo sapiens”，對其進行注釋和預測。收集相關性值大于1的靶點作為疾病靶點。在Venn 2.1.0制圖平臺（https://bioinfogp.cnb. csic.es/tools/venny/index.html）繪制CRC與鴉膽子的交集靶點。

2.1.3 “活性成分-CRC”網絡的構建 通過Cytoscape 3.7.2（https://cytoscape.org）可視化“活性成分-CRC”網絡，連接的節點越密集，受該成分調控的靶點越多，表明該成分是鴉膽子抗CRC的重要活性成分。

2.1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡的構建及關鍵靶點篩選 將CRC靶點導入STRING 11.0數據庫（https://cn.string-db.org）進行分析，模式設置為“多種蛋白”，物種限定為“Homo sapiens”。預讀數據后，其余蛋白的置信度≥0.99，與其余蛋白無聯系的蛋白被隱藏。然后構建PPI網絡，分數設置為0.4，剔除不符合得分的靶標。利用Barplot繪圖函數，對蛋白質連接節點的個數進行技術并繪制直方圖，尋找核心靶點。

2.1.5 基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 利用R 3.6.0軟件進行GO功能富集分析，從靶細胞的分子功能、細胞成分和生物過程確定基因富集的功能，值與富集程度呈正相關。用R將結果繪制成相應的直方圖和氣泡圖，選取篩選校正后＜0.05的富集結果。利用KEGG途徑富集分析獲得樞紐靶點作用的途徑。

2.1.6 分子對接 將小分子藥物的mol2格式的文件導入AutoDockTools（Version 1.5.7），對小分子藥物進行平衡電荷、將非極性氫原子與相對應的碳原子合并等修飾獲得3D結構，然后轉化為PDBQT格式的文件。從蛋白質數據庫（https://www.rcsb.org/，Protein Data Bank，PDB）獲取EGFR（ID：1M17）、Caspase-3（ID：4QUB）、Cyclin D1（ID：5VZU）的晶體結構。通過AutoDockTools對受體蛋白進行去水、加氫、平衡電荷等預處理后轉化為PDBQT格式的文件。利用AutoDockTools對小分子藥物和配體蛋白進行分子對接，將受體和配體的PDBQT文件導入AutoDockTools，構建對接口袋。在大分子上設置中心，并設置、和的參數以保證蛋白質完全被覆蓋。將輸出的最大結合模式數設置為20。分子對接后生成活性位點位置，并計算結合能和氫鍵數。結合能為負值說明小分子藥物配體可以與受體靶點蛋白自發結合，結合能越小說明結合越穩定，結合能＜?17.782 kJ/mol即為能較好結合。用OpenBabel將對接好的文件轉換為PDB格式，通過PyMOL（3D，Version 2.2.0）和LigPlot（2D）對偶聯模型進行可視化，并展示氫鍵，這2種模型都被廣泛應用于可視化對接結果，包括配體與蛋白質主鏈或側鏈元件之間的對接位點和氫鍵相互作用模式。

2.2 鴉膽子苦醇治療CRC的作用研究

2.2.1 細胞培養 HCT116細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。

2.2.2 動物模型的制備 BALB/c-Nu小鼠右背側sc 100 μL HCT116細胞（2×106個），待腫瘤生長體積為80～100 mm3，小鼠隨機分為對照組和鴉膽子苦醇（2 mg/kg）組，每組6只。鴉膽子苦醇溶于1% DMSO和20% β-環糊精中，給藥組ip藥物，對照組ip等體積的DMSO和β-環糊精，每隔1 d給藥1次。每隔1 d記錄腫瘤大小和小鼠體質量，當腫瘤大小達到2000 mm3時，采用頸椎脫位法處死小鼠，收集腫瘤，測量腫瘤體積和質量，采集小鼠眶后靜脈竇全血。

2.2.3 Western blotting檢測腫瘤組織細胞周期、侵襲、遷移、增殖及EGFR/PI3K/Akt通路相關蛋白表達 取各組小鼠腫瘤組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的預冷RIPA裂解液提取蛋白，12 000 r/min離心10 min，取上清，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉30 min，分別加入EGFR（1∶1000）、PI3K（1∶1000）、Akt（1∶1000）、CDK4（1∶1000）、cyclin B1（1∶1000）、cyclin D1（1∶1000）、cleaved Caspase-3（1∶1000）、Bax（1∶2000）、Bcl-2（1∶1000）、MMP7（1∶1500）、MMP2（1∶1000）、GAPDH（1∶20 000）抗體，4 ℃孵育過夜；加入二抗（1∶20 000），室溫孵育1 h。使用電化學發光試劑盒顯影，采用成像儀及Image J 2.1軟件分析條帶灰度值。

2.2.4 肝腎功及血常規指標檢測 采用Shinova血液學分析儀分析小鼠的肝功能指數、腎功能指數和血常規指標，包括丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、γ-谷氨酰轉肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT）、總膽汁酸（total bile acid，T-BIL）、白蛋白（albumin，ALB）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，CREA）、尿酸（uric acid，UA）、白細胞（white blood cell，WBC）、紅細胞（red blood cell，RBC）、血小板（platelet，PLT）和血紅蛋白（haemoglobin，HGB）。

3 結果

3.1 網絡藥理學分析及分子對接

3.1.1 鴉膽子活性成分及對應靶點的獲取 通過TCMSP檢索共獲得67個活性成分，以OB≥30%、DL≥0.18作為補充條件篩選，共獲得15個鴉膽子主要活性成分（表1）。收集活性成分對應的靶點，去除重復值后共獲得34個靶點。

表1 鴉膽子活性成分

3.1.2 CRC相關的靶點及與藥物交集靶點的獲取 Genecard數據庫中檢索到人類CRC相關的靶點共9410個，經過用Venn 2.1.0得到32個鴉膽子與CRC的交集靶點（圖1），包括EGFR、Caspase-3、cyclin D1、CDK4、MMP-9和血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）等。

3.1.3 “活性成分-CRC”網絡的構建 通過Cytoscape 3.7.2可視化“活性成分-CRC”網絡（圖2），包含37個節點和97個連接。橢圓節點表示靶點，方框節點表示活性成分，灰色線表示節點間相互作用。

圖1 鴉膽子活性成分-CRC靶點Venn圖

橢圓節點表示靶點，方框節點表示活性成分，灰色線表示節點間相互作用

3.1.4 PPI網絡分析 將32個鴉膽子與CRC交集靶點輸入STRING，構建PPI網絡（圖3），共獲得32個節點和152條節點之間的連線。節點是鴉膽子與CRC交集靶點編碼的蛋白，節點的連線越多，表示相互作用越多，靶點的作用越重要。根據節點的連線數量，通過Barplot計算并統計前30個靶點（圖4），前3名為EGFR、Caspase-3和cyclin D1。

3.1.5 GO功能和KEGG通路富集分析 如圖5所示，鴉膽子治療CRC主要涉及細胞凋亡、自噬、基因表達負調控、蛋白磷酸化以及蛋白結合、轉錄因子結合等，主要作用于PI3K/Akt信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路和p53信號通路等。

圖3 PPI網絡

圖4 PPI網絡靶點分析

3.1.6 分子對接 選取PPI網絡中排名前3名的靶點EGFR、Caspase-3及cyclin D1，分別與鴉膽子治療CRC的4個關鍵活性成分進行分子對接（圖6），LigPlot將結果二維可視化，標明氫鍵的個數、長度及小分子藥物配體連接的氨基酸殘基（圖7）。一般認為，小于?17.782、?20.92或?29.288 kJ/mol的結合能分別表明配體與受體之間有一定的、好的或較強的結合活性。結合能反映了受體和配體之間結合的可能性。結合能越低，受體與配體的親和力越高，構象越穩定。其中，鴉膽子苦醇與EGFR的結合能最低（?37.530 5 kJ/mol）。與鴉膽子苦醇和木犀草素相比，鴉膽子苷B和β-谷甾醇與3個靶點蛋白的結合能均較高，親和力較低。鴉膽子苦醇與EGFR、Caspase-3及cyclin D1的結合能分別為?37.530 5、?33.137 3、?30.710 6 kJ/mol，平均結合能為?33.792 8 kJ/mol。木犀草素與EGFR、Caspase-3及cyclin D1的結合能為?26.652 1、?30.585 0、?25.689 8 kJ/mol，平均結合能為?27.642 3 kJ/mol。

圖5 GO功能(A) 和KEGG通路(B) 富集分析(前20)

圖6 鴉膽子苦醇、木犀草素與靶點蛋白EGFR、Caspase-3和cyclin D1的3D分子對接結果

圖7 鴉膽子苦醇、木犀草素與靶點蛋白EGFR、Caspase-3和cyclin D1的2D分子對接結果

3.2 鴉膽子苦醇抗CRC的作用驗證

3.2.1 鴉膽子苦醇對荷瘤裸鼠模型腫瘤生長的影響 如圖8所示，與對照組比較，鴉膽子苦醇組裸鼠腫瘤生長速度被明顯抑制（＜0.01），證明了鴉膽子苦醇對CRC具有明顯的抑制作用。

3.2.2 鴉膽子苦醇對荷瘤裸鼠模型腫瘤組織細胞周期、侵襲、遷移、增殖及EGFR/PI3K/Akt通路相關蛋白表達的影響 如圖9所示，與對照組比較，鴉膽子苦醇組腫瘤組織中EGFR、PI3K、Akt、CDK4、cyclin D1、MMP9、MMP7和Bcl-2蛋白表達水平均顯著降低（＜0.01），cyclin B1、cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達水平均明顯升高（＜0.01），Bax/Bcl-2值顯著升高（＜0.01）。

與對照組比較：**P＜0.01，下圖同

圖9 鴉膽子苦醇對荷瘤裸鼠模型腫瘤組織EGFR、PI3K、Akt、CDK4、cyclin D1、cyclin B1、MMP9、MMP7、cleaved Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響(, n = 3)

3.2.3 鴉膽子苦醇對荷瘤裸鼠生物安全性評價 為研究鴉膽子苦醇對荷瘤裸鼠代謝器官的影響，檢測對照組和鴉膽子苦醇組荷瘤裸鼠的肝功能指標（ALT、AST、ALB、γ-GT、T-BIL）及腎功能指標（BUN、CREA、UA）和血常規指標（WBC、RBC、PLT、HGB），如圖10所示，與對照組比較，鴉膽子苦醇組荷瘤裸鼠肝、腎功能和血常規指標均無顯著差異。

圖10 鴉膽子苦醇的生物安全性評估(, n = 3)

4 討論

本研究通過網絡藥理學分析鴉膽子的主要活性成分及其抗CRC的潛在機制，共獲得鴉膽子苦醇、木犀草素、鴉膽子苷B、β-谷甾醇4個小分子藥物活性成分和EGFR、Caspase-3、cyclin D1等32個核心靶點。KEGG通路富集分析表明鴉膽子抑制CRC可能與PI3K/Akt通路、TNF信號通路和p53信號通路等相關。在4個活性成分中，鴉膽子苦醇和木犀草素對應的靶點明顯多于鴉膽子苷B和β-谷甾醇。將網絡藥理學預測的核心成分鴉膽子苦醇及木犀草素與關鍵靶點蛋白進行分子對接，2個核心成分與EGFR、Caspase-3和cyclin D1蛋白的活性結合位點的結合能均小于?16.736 kJ/mol，表明核心成分與關鍵的靶點蛋白之間可以自發結合且具有較強的結合活性。在篩選的4種鴉膽子活性成分中，鴉膽子苦醇和木犀草素均可與EGFR相互作用，EGFR是多種靶向藥物的治療靶點，如吉非替尼和厄洛替尼用于治療非小細胞肺癌，拉帕替尼用于治療晚期或轉移性乳腺癌[19]。本研究發現，木犀草素與EGFR的Lys721、Glu738、Ala731形成3個氫鍵，鴉膽子苦醇與EGFR的Ile917形成1個氫鍵。木犀草素和鴉膽子苦醇對EGFR的親和力表明木犀草素-EGFR、鴉膽子苦醇-EGFR相互作用的有效性。

鴉膽子苦醇是鴉膽子的主要活性成分。已有研究證實，鴉膽子苦醇可以阻斷PI3K/Akt通路的信號傳導，抑制胃癌等多種癌癥的發生發展[20]。網絡藥理學分析結果表明，鴉膽子苦醇可通過EGFR/PI3K/ Akt通路抗CRC。進一步通過Western blotting實驗驗證了鴉膽子苦醇可以使該級聯通路明顯失活從而達到抑制CRC，驗證了網絡藥理學預測結果。本研究通過構建裸鼠移植瘤模型，研究了鴉膽子苦醇對CRC的治療作用。鴉膽子苦醇明顯抑制荷瘤裸鼠模型體內腫瘤的生長，同時與代謝相關的肝臟功能和腎臟功能未受到明顯的影響，血常規指標也沒有觀察到顯著差異。表明鴉膽子苦醇具有很好的抑制CRC腫瘤細胞生長的作用。細胞周期與腫瘤的發展密切相關，主要由G1/G0和G2/M期組成，由cyclin/CDK復合物和CDK抑制劑協調。研究表明，鴉膽子苦醇通過作用于CDK4和cyclin D1調節非小細胞肺癌的G1/G0期，cyclin D1表達的降低導致G1/G0期細胞的阻滯[21]，與本研究的結果一致，表明鴉膽子苦醇能夠誘導腫瘤細胞的G1/G0期阻滯，從而抑制腫瘤細胞增殖。誘導細胞凋亡是抑制腫瘤發展的關鍵環節，受Caspase和Bcl-2家族蛋白的調控，Bcl-2家族蛋白包括促凋亡效應蛋白如Bax和抗凋亡效應蛋白如Bcl-2。促凋亡效應蛋白在凋亡應激源的作用下導致線粒體外膜通透化，釋放細胞色素C來切割Caspase-3，從而導致不可逆的細胞凋亡。鴉膽子苦醇可通過上調cleaved Caspase-3表達和Bax/Bcl-2值，促進多種腫瘤細胞凋亡[22]，與本研究結果一致，表明鴉膽子苦醇可誘導腫瘤細胞凋亡，可能涉及線粒體凋亡途徑。腫瘤轉移是腫瘤患者死亡的相關因素。細胞外基質被MMP修飾和降解，從而導致腫瘤細胞的分離和遷移。本研究發現，鴉膽子苦醇能夠降低腫瘤組織中MMP7和MMP9的表達，具有抑制腫瘤細胞侵襲和遷移的能力，與鴉膽子苦醇對胃癌SGC-7901細胞的作用一致[19]。

藥物的積累和清除可能損害器官。因此，通過對小鼠的血液生化指標來評估鴉膽子苦醇是否具有潛在的毒性作用。結果顯示，肝、腎功能和血常規指標未見藥物引起的顯著性差異。因此，鴉膽子苦醇是一種安全、有效、有前景的抗腫瘤佐劑。然而，本研究有幾個局限性：①來自在線數據庫的信息是基于審查和預測的數據，因此，未經證實和未記錄的化合物或靶點可能未被列入本研究中；②目前對鴉膽子15種化合物的定量測定研究尚不完全，因此，未來應進行內容確定的研究；③鴉膽子苦醇雖然為鴉膽子抗CRC的最重要的生物活性成分，但不能完全代表鴉膽子，因此，需要進一步的研究來探索鴉膽子體內外治療CRC的潛在分子機制。

本研究先通過網絡藥理學闡明了鴉膽子抗CRC最重要的4個生物活性成分（鴉膽子苦醇、木犀草素、鴉膽子苷B、β-谷甾醇）和3個重要靶點（EGFR、Caspase-3、cyclin D1），主要作用于EGFR/ PI3K/Akt信號通路；通過分子對接技術驗證了活性成分與靶點的結合能力，發現鴉膽子苦醇是鴉膽子抗CRC的關鍵成分；體內實驗進一步證明了鴉膽子苦醇抗CRC的作用及分子機制，為鴉膽子治療CRC提供了實驗依據，并為從中藥中探究活性成分、核心靶點和潛在機制提供了方法。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism ofin treatment of colorectal cancer based on network pharmacology and molecular docking

ZHAO Wei-xin, WANG Qing, WANG Meng-qi, JI An-xuan, ZHENG Jing-ying, ZHAO Shu-hua

Department of Obstetrics and Gynecology, Second Hospital of Jilin University, Changchun 130022, China

To explore the active components, key targets and potential mechanisms ofin treatment of colorectal cancer by network pharmacology combined with molecular docking andverification.The active components, corresponding targets and colorectal cancer-related targets ofwere retrieved and collected from the public database. The active components, component-disease intersection targets and possible signal pathways ofin treatment of colorectal cancer were analyzed through network pharmacology. Binding ability of active components to target protein was predicted by molecular docking. The effect and mechanism ofactive components in treatment of colorectal cancer were further verified byexperiments.Among the 15 components that met the screening conditions, four bioactive components (brusatol, luteolin, bruceoside B, β-sitosterol) and 32 therapeutic targets ofwere screened. The epidermal growth factor receptor (EGFR), cystein-asparate protease-3 (Caspase-3) and cyclin D1 were the key targets ofin the treatment of colorectal cancer. EGFR/phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) signaling pathway may played an important role ofin treatment of colorectal cancer. The results of molecular docking showed that all four bioactive components could bind well, and average binding energy of brusatol with three key targets was the most negative and the binding was the most stable, which may be the most effective active component ofagainst colorectal cancer. The results of animal experiments showed that compared with control group, brusatol significantly inhibited the volume and weight of transplanted tumor in nude mice (< 0.01), down-regulated the protein expression levels of EGFR, PI3K and Akt in tumor tissues (< 0.01), down-regulated cyclin D1 and cyclin-dependent kinase 4 (CDK4) expressions (< 0.01), up-regulated the expressions of tumor cell apoptosis related protein such as cleaved Caspase-3 and B-cell lymphoma-2 associated X protein (Bax)/B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) (< 0.01), down-regulated the expressions of migration and invasion related proteins such as matrix metalloproteinase 9 (MMP9) and MMP7 (< 0.01); There was no significant difference in liver function, renal function and blood indexes of nude mice in brusatol group.can treat colorectal cancer through multiple targets and channels, and its main active component is bruceol. Its mechanism may be related to inhibiting EGFR/PI3K/Akt signaling pathway, thus causing G1/G0phase block, inhibiting proliferation, invasion and migration, and promoting cell apoptosis.

(L.) Merr.; brusatol; colorectal cancer; network pharmacology; molecular docking; luteolin; bruceoside B; β-sitosterol; epidermal growth factor receptor; cystein-asparate protease-3; cyclin D1

R285.5

A

0253 - 2670(2023)06 - 1850 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.017

2022-10-29

吉林省發展和改革委員會項目（2014G073）；吉林省直廳局項目（2019SCZT040）；吉林省科技廳基礎處項目（20200201589JC）

趙韋欣，女，碩士，研究方向為婦產科學。Tel: 18438611878 E-mail: zhaoweixinxin@163.com

鄭晶瑩，博士。E-mail: zheng_jy@jlu.edu.cn

趙淑華，女，教授，碩士生導師。E-mail: zhaoshuhua-1966@163.com

[責任編輯 李亞楠]