薏苡仁多糖的分離純化、單糖組成分析及對脾氣虛證調節作用

杜 鎮，張 玲，曹桂云，于瑞雪，崔 媛，田振華，蔣海強*

薏苡仁多糖的分離純化、單糖組成分析及對脾氣虛證調節作用

杜 鎮1，張 玲2，曹桂云3，于瑞雪2，崔 媛2，田振華2，蔣海強1*

1. 山東中醫藥大學中醫藥創新研究院，山東 濟南 250355 2. 山東中醫藥大學，山東 濟南 250355 3. 山東宏濟堂制藥有限公司，山東 濟南 250100

從薏苡仁中分離純化多糖，分析其單糖組成并通過血清代謝組學探討薏苡仁多糖對脾氣虛證的調節作用。石油醚脫脂、熱水抽提、乙醇沉淀、Sevage法除蛋白得到薏苡仁多糖（polysaccharide，CP），經過DEAE-52纖維素離子交換柱、Sephadex G-75柱進行分離純化，得到水洗脫多糖CP-W，氣相色譜分析單糖組成；通過飲食失節（高脂低蛋白飼料）與勞累過度相結合的方法建立大鼠脾氣虛證疾病模型，對獲得的血清進行HPLC-TOF/MS分析，以期從代謝組學角度闡明薏苡仁多糖對其脾氣虛證的調節作用。從薏苡仁中分離純化得到CP-W多糖，其總碳水化合物含量為97.32%，單糖組成分析表明CP-W多糖由-鼠李糖、-阿拉伯糖、-木糖、-葡萄糖、-半乳糖組成，單糖組成比例為0.4∶0.3∶1.1∶97.7∶0.5。與對照組相比，模型組在給予CP-W之后，在血清中發現12種差異代謝物，主要與脂質代謝、能量代謝和激素代謝相關。薏苡仁多糖能改善脾氣虛證模型的生理特征，血清代謝組學結果表明薏苡仁多糖能夠調節脾氣虛證大鼠紊亂的脂質代謝、能量代謝、激素代謝等異常。

薏苡仁；多糖；單糖組成分析；脾氣虛證；代謝組學；脂質代謝；能量代謝；激素代謝

薏苡仁為禾本科植物薏苡L. var.(Roman.) Stapf的干燥成熟種仁，性甘、淡、涼，歸脾、胃、肺經。具有利水滲濕，健脾止瀉等功效[1]。中醫學認為“脾居中焦，主運化，為后天之本，氣血生化之源”。脾氣虛癥是臨床常見的中醫病癥之一，患者多有氣短懶言、形體消瘦、神疲乏力、不思飲食、脘腹脹滿等癥狀[2]。中醫臨床常通過健脾作為主要治療方法，薏苡仁則為常用健脾藥之一。現代研究表明其主要活性成分包括薏苡仁油、薏苡仁酯、多糖、三萜、黃酮和生物堿等多種類化合物，薏苡仁及其化學活性成分具有抗腫瘤、增強免疫、降血糖、抗炎、鎮痛、抗菌和抗氧化等藥理作用[3-4]。但目前薏苡仁多糖對于治療脾氣虛證的作用機制尚不明確。基于此，本實驗采用石油醚脫脂、熱水抽提、乙醇沉淀、Sevage法除蛋白得到薏苡仁多糖，通過飲食不節與勞累過度相結合的方法建立大鼠脾氣虛證疾病模型，通過血清代謝組學評價薏苡仁多糖CP-W對脾氣虛證大鼠的影響。

1 材料

1.1 動物

SPF級Wistar大鼠，共21只，體質量（150±20）g，購自魯抗制藥集團有限公司實驗動物中心，動物許可證編號SCXK（魯）20130001；所有動物研究均按照國際倫理準則和國家衛生研究院關于實驗動物關愛和使用的指南進行。

1.2 試藥與試劑

薏苡仁（產地貴州），批號20140518，購自山東百味堂中藥飲片有限公司，經山東中醫藥大學周鳳秦教授鑒定為禾本科薏苡屬植物薏苡L. var.(Roman.) Stapf的干燥成熟種仁。單糖標準品-葡萄糖（批號Y19F11J108781）、-半乳糖（批號L11M7Y10892）、-鼠李糖（批號012A10K95105）、-阿拉伯糖（批號T05J6C1）、-木糖（批號B02M6W1）、-甘露糖（批號A1606L4546）、-海藻糖（批號Y18M9Y61746）均購自源葉公司，質量分數＞98%。乙酸、醋酸酐、甲醇、正丁醇、三氯甲烷、氫氧化鈉、氯化鈉、溴化鉀、丙酮、濃硫酸、無水乙醇、鹽酸均購自國藥集團上海化學試劑公司（中國，上海）；DEAE-52陰離子樹脂、Sephadex G-75凝膠購自上海源葉生物化學試劑有限公司；吡啶、三氟乙酸、鹽酸羥胺購自天津市科密歐化學試劑有限公司。上述化學品和試劑均為分析級。乙腈、甲醇、甲酸為色譜純，購自美國Thermo公司。

1.3 儀器

安捷倫1260型高效液相色譜儀和6230型HPLC-TOF/MS聯用儀、安捷倫6890N氣相色譜（GC），HP-5毛細管柱、火焰離子化檢測器。

2 方法

2.1 CP-W的分離純化

取干燥薏苡仁，粉碎過60目篩，用石油醚回流脫脂2 h，重復提取3次。棄去廢液，將殘渣揮干溶劑后在pH為5的條件下浸泡10 min。以水為提取溶劑，置于80 ℃的水浴中加熱提取2次，料液比為1∶10，提取時間為2 h；合并濾液，減壓濃縮，加入95%乙醇水溶液過夜，沉淀多糖，在3500 r/min離心10 min。收集多糖沉淀，沉淀用蒸餾水溶解，經Sevage法[5]除蛋白質，需劇烈搖動30 min除去蛋白質，重復幾次，直至無明顯蛋白質產生為止。上清液加入80%乙醇水溶液，靜置12 h，離心。沉淀經丙酮洗滌、五氧化二磷真空干燥以獲得脫蛋白質粗多糖CP。稱取粗多糖加至已平衡好的DEAE-52纖維素柱中，依次用蒸餾水、0～0.6 mol/L NaCl洗脫，體積流量2 mL/min，將收集的水洗脫液經Sephadex G-75凝膠色譜柱純化，用1 mL/min的蒸餾水等度洗脫，收集、濃縮、凍干獲得白色蓬松均一多糖CP-W，薏苡仁多糖熱水浸提收率為6.31%。

2.2 理化性質

對CP-W的理化性質進行初步研究，利用CP-W在水、乙醇、三氯甲烷、丙酮中的溶解情況判斷其溶解度[6]；通過苯酚-硫酸比色法[7]測定CP-W的總糖質量分數；菲林反應、α-萘酚反應、碘化反應和FeCl3反應用于驗證CP-W的性質[6]。

2.3 單糖組成分析

取CP-W（20 mg）在110 ℃下用三氟乙酸（12 mL，2 mol/L）水解3 h，稱取10 mg鹽酸羥胺、8 mg肌醇六乙酰酯、0.6 mL吡啶、1 mL醋酸酐與10 mg完全酸水解樣品進行反應，取1.0 g肌醇、1.5 g鹽酸羥胺、15 mL醋酸酐、1 mL吡啶，參考文獻方法制備肌醇六乙酰酯，將其作為內標[8]。取10 mg每種單糖對照品以制備其相應衍生物。氣相色譜操作條件如下：進樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度350 ℃，程序升溫：120 ℃保持3 min，以8 ℃/min的升溫速率從120 ℃升溫至250 ℃，于250 ℃維持10 min。

2.4 造模、分組與給藥

大鼠適應性飼養3 d后，隨機分為對照組（＝7）、模型組（＝7）和薏苡仁多糖CP-W組（＝7）。對照組給予正常飼料（AIN-76A純化飼料），模型組和CP-W組采用高脂低蛋白飼料（氯化膽堿0.2%、蛋氨酸0.3%、淀粉15%、蔗糖50%、纖維素5%、酪蛋白20%、玉米油5%、多礦3.5%、多維1%），每日下午以10%體質量負重游泳至力竭，連續6周造脾氣虛證大鼠模型。按毛色、體質量消瘦、自主活動等指標評分[9-10]，評價模型。造模成功后[11]，給藥劑量參照《中國藥典》2020年版劑量，CP-W組大鼠ig給予CP-W，劑量為0.911 3 g/(kg·d)，每天1次，持續2周，實驗期間自由飲水。對照組和模型組大鼠給予相同體積的生理鹽水。

2.5 血清樣本采集與處理

大鼠連續正常飼養2周，解剖前12 h禁食不禁水，麻醉后下腔靜脈取血，室溫靜置30 min，在4000 r/min離心15 min，獲得血清，將采集的血清置于–80 ℃冰箱保存待用。

2.6 數據質量評估

所有處理好、待分析血清樣品各移取50 μL，渦旋震蕩，制成質量控制（QC）樣本。

2.7 血清樣品的分析條件

2.7.1 色譜條件 Halo-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美國AMT公司），體積流量為0.30 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量為5 μL，流動相為含0.05%甲酸的水溶液（A）-含0.05%甲酸的乙腈溶液（B）；梯度洗脫：0～10 min，10%～65% B；10～20 min，65%～100% B；20～30 min，100% B。

2.7.2 質譜條件 采用ESI源，用正離子采集模式，干燥氣溫度和干燥氣流量分別設置為350 ℃和10 mL/min，毛細管電壓設置為4000 V，霧化器壓力設置為241.325 kPa，碎裂電壓為120 V。全掃描方式，質量掃描范圍/100～1000。

2.7.3 數據處理與統計分析 將獲得的質譜數據（.raw格式）導入R語言軟件進行數據校正。校正后的數據導入SIMCA-P 11.5軟件（Umetrics公司，瑞典）進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least-squares discrimination analysis，PLS-DA）。將變量重要性投影值（variable importance in projection，VIP）＞1且值＜0.05、FC（fold change）值≥2的變量視為潛在的差異代謝物，通過人類代謝組數據庫（human metabolome database，HMDB）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encylopaedia of genes and genomes，KEGG）對得到的差異代謝物進行鑒別。共鑒定出12個差異代謝物。

3 結果

3.1 多糖的分離和純化

由圖1可見，經蒸餾水和NaCl溶液梯度洗脫后，薏苡仁粗多糖分離得到2個主要組分，分別是蒸餾水洗脫組分CP-W和0.3 mol/L NaCl溶液洗脫組分CP-A，為了將高純度的多糖用于單糖組成分析和活性評價，通過Sephadex G-75凝膠色譜柱進一步純化保留時間和峰形穩定的水洗脫液，以獲得純多糖（圖2），經SephadexG-75凝膠色譜柱純化的多糖流出曲線呈單一峰，說明CP-W是相對分子質量分布均一的多糖組分。

圖1 DEAE-52纖維素離子交換柱上CP的洗脫曲線

圖2 CP-W在Sephadex G-75柱上的洗脫曲線

3.2 CP-W的理化性質分析

CP-W為白色粉末，無臭，松散易溶于水，難溶于乙醇、丙酮等有機溶劑。菲林反應、Molish反應、碘呈色反應和FeCl3反應的結果表明，CP-W由可還原性多糖組成，CP-W的總糖質量分數為97.32%。

3.3 單糖組成分析

對含有-葡萄糖、-半乳糖、-鼠李糖、-阿拉伯糖、-木糖、-甘露糖、-海藻糖的標準單糖混合樣品進行GC分析，得到各標準單糖的保留時間，并對其定性，結果見圖3。根據混和標準品各單糖的保留時間，由GC分析可知CP-W由5種單糖組成，由峰面積歸一化法計算其單糖組成比例為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖為0.4∶0.3∶1.1∶97.7∶0.5。

1-鼠李糖 2-阿拉伯糖 3-巖藻糖 4-木糖 5-甘露醇 6-葡萄糖 7-半乳糖

3.4 血清樣品質譜檢測分析

將血清樣本處理后進行正離子模式全掃描，樣品總離子流圖如圖4所示。

3.5 數據質量評估結果

血清樣本在分析過程中共運行6個QC樣本，將獲得的QC數據進行預處理后進行PCA分析，結果見圖5，正離子模式下QC樣本明顯聚集，證明此條件下儀器穩定，數據質量可靠。

3.6 CP-W干預對脾氣虛證大鼠生物標志物的影響分析

利用無監督的PCA分析對預處理后的模型組、對照組、CP-W組之間的差異進行統計學分析，結果見圖6-a，圖中模型組與對照組、模型組與CP-W組明顯分離，表明大鼠血清代謝產物具有差異，PLS-DA分析中發現，模型組大鼠血清代謝物與對照組存在顯著差異，CP-W組大鼠血清代謝物與模型組存在顯著差異。

圖4 對照組、模型組、CP-W組大鼠血清總離子流圖

圖5 大鼠血清代謝組學數據PCA圖

3.7 CP-W治療大鼠組血清生物標志物分析與鑒定

按照代謝物載荷圖（圖7）中距原點越遠對分組差異貢獻（VIP）越大原則，篩選得到VIP＞1的代謝物，結合代謝物峰面積的獨立樣本檢驗，確定具有顯著差異的血清代謝物，根據相對分子質量和質譜圖初步鑒定出潛在的生物標志物，這些篩選后的生物標志物在S-Plot中用紅色標記。最終在血清樣本中鑒定出12個潛在的生物標志物，結果見表1。此外，根據篩選出的12個潛在生物標志物的相對豐度構建熱圖來直觀地顯示3組之間的差異，見圖8。

圖6 對照組、模型組、CP-W組PCA圖(a) 和PLS-DA散點圖(b)

圖7 PLS-DA的S-Plot圖

4 討論

本研究利用液質聯用技術，從代謝組學角度闡明薏苡仁多糖對脾氣虛證的調節作用，發現干預后-棕櫚酰肉堿（-palmitoylcarnitine）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid）、睪酮（testosterone）等5種代謝物上調，18∶3 (6,9,12)-溶血磷脂酰膽堿 [18∶3（6,9,12）-lysophosphatidylcholine]、18∶4-磷脂酰膽堿（18∶4-phosphatidyl choline）、18∶0-膽甾醇酯（18∶0-cholesteryl ester）、d18∶1/9-18∶1-神經酰胺（d18∶1/9-18∶1-ceramide）等7種代謝物下調（圖8）。提示脾氣虛證大鼠體內能量、脂質、激素代謝紊亂。

表1 血清樣本差異代謝物

肉堿是一種在肝臟、腎臟和大腦中合成的類維生素化合物，是動物脂肪酸代謝的一個重要因素，主要參與體內脂肪酸的氧化過程。長鏈脂肪酸與肉堿結合生成酰基肉堿并轉移到線粒體[12]，在酶的作用下，長鏈脂肪酸與肉堿結合發生β-氧化生成ATP，提供物質代謝所需的能量[13-14]。脾氣虛癥大鼠的L-棕櫚酰肉堿含量顯著低于正常大鼠，提示體內脂肪酸β-氧化活性降低，線粒體正常供能發生障礙。膽堿一種對所有細胞正常功能都至關重要的成分，研究報道溶血磷脂酰膽堿能夠通過促進氧化應激，抑制葡萄糖轉運和胰島素介導的葡萄糖代謝，抑制Na+-K+-ATP酶的活性而引起細胞結構和功能紊亂[15]，薏苡仁多糖CP-W干預后，溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿下調，提示薏苡仁多糖CP-W可以調節體內能量代謝改善脾氣虛證引起的代謝紊亂。

圖8 對照組、模型組和CP-W組之間12種內源性差異代謝物的熱圖

鞘磷脂是含鞘氨醇或二氫鞘氨醇的磷脂，是細胞膜的重要組成成分[16]，具有一定調節脂質代謝的作用[17]。磷脂與肉堿都是參與脂肪代謝的重要物質，其水平降低與脂肪代謝紊亂有關。持續磷脂與肉堿的缺乏會加重脂肪代謝的紊亂[18]。薏苡仁多糖干預后鞘磷脂回調，提示可以通過調節大鼠體內改善脂質代謝紊亂水平達到保護機體作用。二十二碳六烯酸一種長鏈不飽和脂肪酸，在體內主要參與膽固醇的氧化和運輸，降低血液中膽固醇及其與脂肪酸酯化所形成的膽固醇酯的量[19]，研究表明膳食補充二十二碳六烯酸可以降低小鼠血漿膽固醇[20]。脾氣虛證大鼠體內不飽和脂肪酸減少，使之與膽固醇結合減少，從而是膽固醇代謝產物減少，導致脾氣虛證大鼠機體膽固醇代謝紊亂。薏苡仁多糖干預后二十二碳六烯酸呈現上調趨勢，膽固醇、膽固醇酯等代謝物呈下調趨勢，可能與薏苡仁多糖通過調節二十二碳六烯酸從而調節膽固醇代謝。

激素代謝：睪酮是最主要的雄激素，可以維持第二性征，維持生育能力、促進蛋白質的形成，而且可以影響血脂、血糖等代謝[21]。睪酮缺乏可表現為肌肉質量和力量的減少、血糖和血脂代謝異常、內臟脂肪質量的增加、骨質疏松癥的發生、嗜睡、精力不足和情緒變化等[22]，CP-W干預后脾氣虛證大鼠宏觀指標恢復正常，提示薏苡仁多糖CP-W可以通過調劑機體激素代謝紊亂發揮作用。

綜上所述，脾氣虛證模型可造成大鼠機體正常生理功能紊亂，脾氣虛證大鼠血清代謝組結果顯示薏苡仁多糖CP-W可能通過調節能量代謝、脂質代謝、激素代謝等途徑發揮作用，通過血清代謝組鑒定了血清中與脾氣虛證相關的12種生物標志物。為進一步探討脾氣虛證發病機制和推斷薏苡仁多糖治療脾虛證的作用機制，提供了科學的思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Isolation, purification and monosaccharide composition analysis ofpolysaccharide and its regulatory effect on spleendeficiency syndrome

DU Zhen1, ZHANG Ling2, CAO Gui-yun3, YU Rui-xue2, CUI Yuan2, TIAN Zhen-hua2, JIANG Hai-qiang1

1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine Innovation Research Institute, Jinan 250355, China 2. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China 3. Shandong Hongjitang Pharmaceutical Co., Ltd., Jinan 250100, China

To isolate and purify polysaccharide from, analyze its monosaccharide composition, and explore the regulatory effect ofpolysaccharide on spleendeficiency syndrome through serum metabolomics.polysaccharide (CP) was obtained by degreasing with petroleum ether, hot water extraction, ethanol precipitation and protein removal by Sevage method. After separation and purification by DEAE-52 cellulose ion exchange column and sephadexg-75 column, the water washed polysaccharide CP-W was obtained, and the monosaccharide composition was analyzed by gas chromatography (GC); The disease model of spleendeficiency syndrome in rats was established by the combination of diet disorder (high-fat and low protein diet) and overwork. The obtained serum was analyzed by the HPLC-TOF/MS, in order to clarify the regulatory effect of CP on spleendeficiency syndrome from the perspective of metabolomics.CP-W polysaccharide was isolated and purified from, and its total carbohydrate content was 97.32%, monosaccharide composition analysis showed that CP-W polysaccharide was composed of-rhamnose,-arabinose,-xylose,-glucose and-galactose, The monosaccharide composition ratio was 0.4∶0. 3∶1.1∶97.7∶0.5. Compared with the control group, 12 different metabolites were found in the serum of the model group after CP-W administration, mainly related to lipid metabolism, energy metabolism and hormone metabolism.CP could improve the physiological characteristics of spleendeficiency syndrome model. The results of serum metabolomics show that CP can regulate the disorder of lipid metabolism, energy metabolism, hormone metabolism and other abnormalities in rats with spleendeficiency syndrome.

; polysaccharide; monosaccharide composition analysis; spleendeficiency evidence; metabolomics; lipid metabolism; energy metabolism; hormone metabolism

R284.1

A

0253 - 2670(2023)06 - 1736 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.005

2022-09-05

國家重點基礎研究發展計劃“973”課題（2013CB531803）；山東省青創人才引育計劃

杜 鎮（1997—），女，在讀碩士研究生，研究方向為中藥及天然藥物化學成分。Tel: 17860503757 E-mail: dz03210614@163.com

蔣海強，教授，研究方向為中藥及復方活性成分與質量控制。Tel: 15966050664 E-mail: jhq12723@163.com

[責任編輯 王文倩]