微針對白脈軟膏經皮滲透性及應用安全性研究

肖五慶，梁 軍，竺楹銀，劉凱列，鐘宛凌，楊天姿，席 鋮，胡曉紅，武慧超*，杜守穎*

微針對白脈軟膏經皮滲透性及應用安全性研究

肖五慶1，梁 軍1，竺楹銀1，劉凱列2，鐘宛凌1，楊天姿1，席 鋮1，胡曉紅1，武慧超1*，杜守穎1*

1. 北京中醫藥大學，北京 102488 2. 西藏奇正藏藥股份有限公司，西藏 林芝 860000

為改善白脈軟膏經皮滲透性，采用微針技術進行促透，考察其對白脈軟膏經皮滲透性和應用安全性的影響，以篩選安全、有效的微針應用條件。以小鼠腹皮作為實驗材料，采用改良的Franz擴散池進行體外滲透性評價，計算不同微針條件下白脈軟膏3個主要成分甘草酸銨、甘松新酮、姜黃素的24 h累積經皮滲透量及穩態透皮速率，評估促透性能；采用光學相干斷層掃描法（optical coherence tomography，OCT）記錄微針處理后0、10、20、30、40、50、60、90、120 min時的微孔道深度，進而對皮膚損傷及恢復程度進行量化評分，作為安全性評價依據。綜合體外滲透性、皮膚損傷及恢復程度為評分指標（權重分別占40%、30%、30%），運用正交試驗設計將微針長度、作用力度和作用時間作為考察因素進行條件優化，篩選適宜的微針條件。3個因素對綜合評分的影響大小為微針長度＞作用時間＞作用力度，最終篩選出的微針條件為微針長度250 μm、作用力度5 N、作用時間5 min。綜合考慮了微針對白脈軟膏體外滲透性、皮膚損傷及恢復程度的影響，為白脈軟膏及微針促透的臨床合理安全應用提供理論參考。

白脈軟膏；微針；經皮滲透；光學相干斷層掃描法；綜合評價；甘草酸銨；甘松新酮；姜黃素

白脈軟膏是藏醫基于白脈理論創制的經典外用制劑，400年前《藏醫臨床札記》便有記載，應用歷史悠久[1]。其處方由姜黃、肉豆蔻、干姜等11味藥組成[2]，常用于治療神經系統疾病、肌肉骨骼系統損傷和感覺功能障礙等，有良好的臨床療效[3-4]。然而，臨床常需要輔以電磁波、紅外照射、推拿針灸等手段以促進藥物透皮吸收[5-7]，導致了其臨床療效的參差不一。同時在本課題組前期對白脈軟膏的體外滲透性研究中，也發現其主要活性成分的經皮透過量較低[8]，課題組先后研究了常用化學促透劑和超聲技術對白脈軟膏3種主要成分的促透作用[9]，2種方式均改善了白脈軟膏的經皮吸收，但是二者對不同性質的成分的促透性能有所區別，超聲對水溶性成分甘草酸銨的促透效果良好，而脂溶性成分甘松新酮和姜黃素更適合采用3%丙二醇促透，為兼顧水溶性和脂溶性成分，需要尋找更合適的促透方式。

微針可以穿透角質層并留下微小孔道，具有顯著的促滲效果，同時不會觸及神經而不產生痛感，近年來已被廣泛用于各類藥物的經皮給藥，尤其是大分子蛋白質[10]、肽類[11]、DNA[12]等，也見于中藥成分的透皮給藥[13-14]。目前，關于微針的研究也愈加廣泛深入，如幾何形狀、尺寸、材料、作用方式、作用皮膚等，但是將促透效果與安全性結合的綜合評價研究還較為匱乏。在臨床中，需要同時考慮微針使用的安全性問題，不同參數的微針在皮膚形成的孔道不一，而孔道的閉合是影響藥物滲透和安全性的關鍵因素[15]。光學相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）是測試微針刺入皮膚微孔參數最常用的技術手段之一，利用生物組織內部光學反射特性的空間變化進行成像[16]，由于不需要對組織進行處理破壞、允許實時原位成像、探測靈敏度高等優點，也被稱為“光學活檢”[17-18]。

本實驗考察微針對白脈軟膏的促透效果，采用改良的Franz擴散池法研究白脈軟膏主要成分的體外滲透性，通過OCT系統觀察微孔道變化，結合皮膚的損傷及恢復程度進行綜合評價，基于正交試驗對微針長度、作用力度及作用時間進行優選，以篩選最適宜的微針促透條件，為白脈軟膏及微針促透的臨床合理安全應用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Uitimate 3000型高效液相色譜儀，TCC-3000SD型檢測器，四元低壓梯度泵，柱溫箱，自動進樣器，賽默飛世爾科技有限公司，Chromeleon 7型色譜工作站；TK-121型藥物透皮擴散試驗儀，配套改良Franz擴散池，＝1.0 cm，＝3.14 cm2，＝20 mL，天津市正通科技有限公司；掃頻OCT（Swept-source OCT，SS-OCT）系統，北京理工大學自研；RE-539C型雷瓦電動理發器，上海雷瓦電器有限公司；DRS Dermaroller System滾輪微針，250、500、750 μm，圓錐狀金屬針形，針孔密度為60針/cm2，廣州市名摩貿易有限公司。

1.2 材料

白脈軟膏，批號170915，西藏奇正藏藥股份有限公司；對照品甘草酸銨（批號110731-201720，質量分數93.0%）、甘松新酮（批號111832-201704，質量分數98.2%）、姜黃素（批號110823-201706，質量分數98.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、磷酸，色譜純，Fisher公司；純凈水，娃哈哈集團有限公司；聚乙二醇400，天津市福晨化學試劑廠，分析純；氯化鈉注射液，石家莊四藥有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3 動物

雄性昆明種（KM）小鼠，SPF級，體質量為 （20±2）g，北京斯貝福生物技術有限公司提供，合格證號SCXK（京）2016-0002，所有動物實驗遵循北京中醫藥大學動物實驗倫理委員會關于實驗動物管理和使用的規定，動物實驗倫理批準號為BUCM-4-2019101701-4001。

2 方法與結果

2.1 微針處理及微孔道深度測定

2.1.1 離體皮膚的制備 以雄性KM小鼠的腹部皮膚作為透皮材料，小鼠頸椎脫臼處死，先后用電動剃毛器和脫毛膏脫毛。剪下腹部皮膚，用浸濕生理鹽水的棉球除去皮下組織和脂肪，選取無破損的完整皮膚，用生理鹽水沖洗干凈，封裝于錫箔紙中，?20 ℃凍存備用（1周內使用）。

2.1.2 微針處理方法 準備適當厚度的土豆切片（厚度均勻、切面平整），將小鼠離體皮膚置于切片之上，使皮膚里層與其充分貼合，將載有皮膚的土豆片置于電子天平上，用滾輪微針在皮膚的有效給藥面積內反復滾動，滾動頻率為16次/min。

2.1.3 微孔道深度測定方法 光學相干斷層掃描系統常用來評價孔道的形成與閉合[15]，結構示意圖見圖1。小鼠皮膚經微針處理后立即置于OCT系統下進行掃描，移動載物平臺，找到微孔道，設置掃描光源中心波長為1310 nm，縱向分辨率為10 μm，橫向分辨率為22 μm，掃描范圍9.3 mm×9.3 mm，掃描頻率為100 kHz，輸出功率為20 mW，分別于0、10、20、30、40、50、60、90、120 min進行拍照采集，測量微孔道深度。

2.2 微針促透條件優選的正交試驗設計

選取影響微針透皮效果及安全性的3個主要因素[15]，包括微針長度（A）、作用力度（B）及作用時間（C），每個因素設置3個水平，具體范圍參考Huang等[19]的實驗，因素水平、實驗設計與結果見表1。改變微針長度、作用力度及作用時間，進行3因素3水平的L9(34)正交試驗（壓力＝，即天平所顯示的穩定讀數，微針滾動時保持平衡，將天平示數控制在±20%的誤差內，＝9.8 N/kg），不進行微針處理的作為空白組。

圖1 OCT實驗系統

2.3 甘草酸銨、甘松新酮、姜黃素的定量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 取甘草酸銨、甘松新酮、姜黃素對照品適量，精密稱定，加甲醇制得含甘草酸銨46.240 μg/mL、甘松新酮3.704 μg/mL、姜黃素3.280 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3.2 白脈軟膏接收液供試品溶液的制備 用改良的立式Franz擴散池，供給池半徑為1.0 cm，滲透面積為3.14 cm2，接收池容積為20 mL。將干凈完整的小鼠皮膚置于透皮擴散池的兩室之間，使皮膚角質層面向供給室，皮膚里層與接收液（根據課題組前期篩選結果[2,8]，選擇30%聚乙二醇-30%乙醇-40%生理鹽水為接收液）保持緊密接觸。準確稱取白脈軟膏1 g均勻涂布于皮膚表面，接收室加入20 mL接收液，恒溫（37.0±0.5）℃，攪拌速度350 r/min，于透皮24 h取樣1 mL，以24 h的透皮接收液用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3.3 色譜條件 參照課題組前期建立的高效液相色譜法，對透皮液中的3個主要成分甘草酸銨、甘松新酮、姜黃素進行定量[2,8]。Waters Xselect?HSS T3C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～10 min，22%乙腈；10～15 min，22%～50%乙腈；15～35 min，50%～55%乙腈；35～40 min，55%～71%乙腈；40～50 min，71%～95%乙腈；50～55 min，95%乙腈；55～60 min，95%～22%乙腈；柱溫30 ℃，體積流量1.0 mL/min；檢測波長237、254、430 nm，進樣體積25 μL。色譜圖見圖2。

表1 微針促透正交試驗設計與結果

圖2 空白接收液 (A)、混合對照品溶液 (B)、白脈軟膏接收液 (C) 在不同波長下的HPLC圖

2.4 不同微針條件對藥物經皮滲透性的比較研究

本實驗采用改良的Franz擴散池法，將微針處理后小鼠皮膚置于擴散池的兩室之間，使皮膚角質層面向供給池，向接收池加入20 mL接收液及磁力轉子，皮膚里層與接收液保持緊密接觸。準確稱取白脈軟膏1 g均勻涂布于皮膚表面，透皮擴散試驗儀保持恒溫（37.0±0.5）℃，攪拌速度350 r/min，分別于6、8、10、12、20、24 h從接收池取樣1 mL，同時補充同溫度等體積新鮮接收液，并排除氣泡。取出的接收液用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液，用“2.1”項下方法測定24 h接收液中甘草酸銨、甘松新酮、姜黃素的含量，計算各成分不同時間點的單位面積累積透過量（Q）和穩態透皮速率（s）。以待測成分不同時間點的Q為縱坐標，取樣時間為橫坐標繪制Q-t曲線，取曲線的直線部分進行線性回歸，其斜率即為s，即藥物滲透達到穩態后的透皮速率。Q、EF和ER由公式計算。

EF＝Q-24 h/0-24 h

ER＝si/s0

Q為第次取樣時接收液中待測成分的單位面積累積透過量，為有效擴散面積，為接收池中接收液總體積，C為第次取樣時接收液中待測成分的質量濃度，C為第次取樣時接收液中待測成分的質量濃度。EF表示在24 h時促透組各成分的單位面積累積透過量與空白組的比值，代表促透性能，Q-24 h、0-24 h分別為24 h促透組和空白組的單位面積累積透過量，ER為促透倍數，si為促透組的穩態透皮速率，s0為空白組的穩態透皮速率

以待測成分不同時間點的累積透過量Q為縱坐標，取樣時間為橫坐標，繪制Q-曲線，結果如圖3所示。相對空白組，小鼠皮膚經微針處理后，對白脈軟膏中甘草酸銨、甘松新酮、姜黃素的透皮吸收有明顯的促進作用。

對白脈軟膏中3種成分的透皮吸收動力學參數進行分析，結果見表2，所有回歸方程值均大于0.95，可信度高。

小鼠皮膚經微針處理后，對白脈軟膏中3種成分的透皮吸收均有促進作用，其綜合促透效果明顯優于空白組。值得注意的是，微針處理對不同成分的促透程度也有所差別，甘草酸銨組、姜黃素組的ER最高可達15.70、16.12，而微針處理對甘松新酮的促透性能偏低，這與課題組前期采用超聲促透的結果一致[9]，這可能與甘松新酮的化學性質有關。Shen等[20]研究了藥物理化性質對疏水性藥物納米混懸劑體外透皮吸收的影響，發現lg是影響透皮吸收的關鍵因素，lg接近3時體外透皮效果最好。本研究中，甘松新酮相較甘草酸銨、姜黃素，具有更高的脂溶性，其lg在3左右，在不采用任何促透方式時，其24也達到了19.417 μg/cm2，分別是甘草酸銨、姜黃素的3.35、56.12倍，故而甘松新酮組的ER相對偏低。綜上，微針處理可以明顯改善白脈軟膏中各成分的透皮吸收。

2.5 皮膚損傷程度及恢復程度評分研究

微針作用后，皮膚會留下明顯孔道，采用OCT法觀察2 h內的微孔道深度變化。本實驗以0 h的皮膚損傷程度及2 h的恢復程度評分作為安全性評價的依據，其中皮膚損傷程度評分越高，對皮膚損傷程度越大，皮膚恢復程度評分越接近1，恢復情況越好。

與空白組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

皮膚損傷程度評分＝(0 h實驗組微孔道深度－0 h空白組微孔道深度)/0 h空白組微孔道深度

皮膚恢復程度評分＝(0 h實驗組微孔道深度－2 h實驗組微孔道深度)/(0 h實驗組微孔道深度－0 h空白組微孔道深度)

將不同長度微針置于OCT系統下進行掃描，確定1 mm長度對應213像素（圖4）。未進行微針處理的小鼠皮膚OCT掃描圖像如圖5所示，基于像素計算小鼠腹部皮膚厚度約為586.85 μm，從圖中可以清晰地觀察到角質層、表皮層和部分真皮層，且表面完整無破損。

正交試驗組施加微針后2 h內的微孔道狀態變化如圖6所示，結果顯示，在微針的作用下，小鼠皮膚表面短時間內均會生成微孔道（圖中箭頭所示）。不同微針作用條件下形成的微孔道的深度有所差異，結合OCT掃描圖可看到30 min后S1、S2 2組便無微孔道的痕跡，而S4～S9組在微針處理2 h后仍存在明顯的孔道。相較前2組，S4～S9組所選用的微針長度更大，即使降低作用力、縮短作用時間，2 h內皮膚也不能夠完全恢復，說明微針長度對皮膚狀態影響較大。

以時間為橫坐標，微孔深度為縱坐標做圖（圖7）。微針作用后立即觀察，在S9、S5實驗條件下，皮膚表面形成的微孔道深度分別為248.83、206.57 μm，說明了作用力度及時間對皮膚的影響也較大。2 h內各組均有不同程度的恢復，微針作用后30 min內微孔道深度恢復速度較快，在90 min后恢復變緩，這也提示微針作用后應當及時給藥，以發揮微針最大的促透作用。

由于毛囊等附屬器存在，不施以任何微針處理的正常小鼠皮膚也不是完全平坦光滑的，其正常深度保持在40～50 μm，故以此次空白組測得的46.95 μm作為基準進行打分。隨著微針長度增加、作用力度增大、作用時間延長，皮膚損傷程度評分越高，其中S9、S5皮膚損傷程度評分最高，且2 h后的皮膚恢復程度也偏低，可見對皮膚造成了嚴重損傷，短時間內不能恢復。

2.6 微針促透的綜合性評價

實驗選用L9(34)正交表，結合滲透性指標、皮膚損傷程度及皮膚恢復程度，進行綜合評分，綜合評分＝滲透性評分/最高滲透性評分×0.4＋恢復程度評分/最高恢復程度評分×0.3－損傷程度評分/最高損傷程度評分×0.3。滲透性實驗采用體外Franz擴散池法，考察不同微針條件對白脈軟膏中3種成分甘草酸銨、甘松新酮、姜黃素的促透效果，由于白脈軟膏處方中姜黃的藥材量最高，甘松和甘草藥材量相當，設置3個指標甘草酸銨、甘松新酮、姜黃素的滲透性得分占比分別為30%、30%、40%，滲透性評分＝甘草酸銨EF×0.3＋甘松新酮EF×0.3＋姜黃素EF×0.4。同時以OCT實驗系統觀察微針作用皮膚的微孔道深度，評估皮膚的損傷程度和恢復程度，以滲透性、皮膚損傷及恢復程度評分作為綜合指標，優選出更全面合理的微針促透條件，正交試驗結果見表1，方差分析結果見表3。

表2 不同微針條件下白脈軟膏中3種成分的經皮滲透參數(, n = 6)

圖4 不同長度250 μm(a)、500μm(b)、750μm(c)滾輪微針的OCT圖像(標尺：500μm)

圖5 小鼠腹部皮膚OCT圖(標尺：500μm)

圖6 正交試驗組施加微針后2 h內的微孔道變化過程

圖7 不同微針條件處理小鼠皮膚后微孔道隨時間的變化過程

從方差分析結果可知，A（微針長度）、B（作用力度）、C（作用時間）3因素對綜合評分的影響大小為A＞C＞B，且A1＞A2＞A3，C2＞C3＞C1，B3＞B2＞B1，其中A對綜合評分的影響顯著（＜0.05），因素B和C未顯示出統計學差異，這可能是由于實驗設計方案需要兼顧臨床安全性，設置的因素水平間距不大導致的作用力度及作用時間差異不顯著。為了最大限度增加白脈軟膏的經皮吸收，提高療效，B、C 2因素采用最高水平組合，同時也是正交表中綜合評分（42.46%）最高的一組，確定微針最佳促透條件為A1B3C3，即微針長度250 μm，作用力度5 N，作用時間5 min。

表3 方差分析結果

3 討論

在本研究中，微針能夠顯著改善白脈軟膏的體外滲透性，不同微針條件滲透性評分為2.90～11.66分。在課題組前期研究中[8-9]，3%丙二醇為最佳化學促透條件，滲透性評分為2.414分，超聲促透最佳條件為1.0 W/cm2、5 min、1 MHz，滲透性評分為1.958分。微針對3種不同極性成分的促透效果均明顯優于3%丙二醇和超聲技術，這證明了微針在促進藥物經皮滲透方面的巨大優勢。本實驗采用OCT系統對微針的穿刺安全性進行了研究，在該系統下，能夠清晰地看到微針的邊緣、刺入深度和在皮膚上留下的微孔道，可以通過測量孔道深度對皮膚損傷程度及皮膚恢復程度進行評分。應用微針2 h后，微孔道的愈合速度變得極其緩慢，這與Huang等[19]的結果一致，故以2 h內微孔道的參數變化作為評分依據。

小鼠腹皮角質層厚度在50 μm左右[21-22]，相對空白組，本實驗中S1、S2所留下的孔道均小于50 μm，未穿透角質層，且30 min后便完全閉合，2組對于3種主要成分的促透效果偏低，說明微針只有穿透角質層才能達到理想的透皮效果。為了兼顧滲透效果和安全性，本研究采用正交設計以滲透性、皮膚損傷及恢復程度進行綜合評價，結果顯示微針長度是影響綜合評分的關鍵因素。但是，若僅以滲透性作為指標，則微針長度對促透的貢獻最低，增加微針長度所帶來的皮膚損傷更為明顯。提示在應用微針時可先確定合適的微針長度，再考慮改變作用力度、作用時間等因素進一步提高滲透量，而非一味靠增加微針長度以提高滲透量。本實驗對微針長度、作用力度及時間進行了考察，得到了250 μm、5 N、5 min這個最優條件，但是考慮到微針參數及實驗條件等的復雜性，仍需進一步系統性探索研究影響滲透及安全性的關鍵因素及規律，為微針的臨床安全合理應用提供理論支撐。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on percutaneous permeability and application safety of microneedles targeting Baimai Ointment

XIAO Wu-qing1, LIANG Jun1, ZHU Ying-yin1, LIU Kai-lie2, ZHONG Wan-ling1, YANG Tian-zi1, XI Cheng1, HU Xiao-hong1, WU Hui-chao1, DU Shou-ying1

1. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China 2. Tibet Cheezheng Tibetan Medicine Co., Ltd., Linzhi 860000, China

In order to improve the percutaneous permeability of Baimai Ointment (白脈軟膏, BO), microneedle technology was used to promote penetration, and its effects on the percutaneous permeability and application safety of BO were investigated to screen safe and effective microneedle application conditions.The abdominal skin of mice was used as experimental material, and the improved Franz diffusion cell was used to evaluate the permeability. The 24 h cumulative transdermal penetration amount and steady-state percutaneous penetration rate of ammonium glycyrrhizinate, nardosinone and curcumin, the three main components of BO under different microneedle conditions, were calculated to evaluate the penetration performance. Optical coherence tomography (OCT) was used to record the depth of micropores at 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90, and 120 min after microneedle treatment, and then the degree of skin damage and recovery was quantified as the basis for safety evaluation. The external permeability, skin damage and recovery degree of the complex were taken as the scoring indexes (the weights were 40%, 30% and 30%, respectively). The length, action intensity and action time of the microneedle were used as the investigation factors to optimize the conditions by orthogonal experimental design, and the appropriate microneedle conditions were screened.The results showed that the influence of three factors on the comprehensive score was microneedle length > action time > action intensity, and the final microneedle condition was microneedle length 250 μm, action force 5 N, action time 5 min.In this paper, the effects of microneedle on the permeability, skin damage and recovery of BOwere comprehensively considered to provide theoretical reference for rational and safe clinical application of BO and microneedle penetration promotion.

Baimai Ointment; microneedle; percutaneous penetration; optical coherence tomography; comprehensive evaluation; ammonium glycyrrhizinate; nardosinone; curcumin

R283.6

A

0253 - 2670(2023)06 - 1766 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.008

2022-09-10

國家自然科學基金項目（82104545）；國家重點研發計劃（2019YFC1712403）；中央高校基本科研業務費專項資金資助（2020-JYB-ZDGG-024）

肖五慶（1999—），女，碩士研究生，從事中藥新劑型和新技術研究。E-mail: bucmxiaowuqing@163.com

杜守穎，博士，教授，主要從事中藥新劑型新技術研究。Tel: (010)84738615 E-mail: dushouying@263.net

武慧超，博士，助理研究員，主要從事民族藥學研究。Tel: (010)64286010 E-mail: wuhuichao1011@126.com

[責任編輯 鄭禮勝]