基于HPLC指紋圖譜及多指標成分測定結合化學計量學的不同商品規格山慈菇質量差異分析

郝壯壯，曹宇欣#，劉朦朦，薛靜文，張 鴿，蘆藝凡，范文昕，周 瑩，馮 靚，王春國，石晉麗

基于HPLC指紋圖譜及多指標成分測定結合化學計量學的不同商品規格山慈菇質量差異分析

郝壯壯1，曹宇欣1#，劉朦朦1，薛靜文1，張 鴿1，蘆藝凡1，范文昕1，周 瑩3，馮 靚4，王春國2*，石晉麗1*

1. 北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488 2. 北京中醫藥大學中醫藥研究院，北京 102488 3. 北京市朝陽區高碑店社區衛生服務中心，北京 100124 4. 北京市朝陽區望京社區衛生服務中心，北京 100102

建立山慈菇的HPLC指紋圖譜，對其特征成分進行含量測定并結合化學計量學分析方法分析不同商品規格山慈菇（冰球子、毛慈菇）化學成分的差異，為山慈菇藥材的質量控制提供參考。優化山慈菇藥材的提取方法，應用HPLC法分別建立冰球子和毛慈菇指紋圖譜，并對特征成分進行含量測定。采用相似度評價、聚類分析（cluster analysis，CA）、主成分分析（principalcomponent analysis，PCA）、正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）、Fisher線性判別分析（fisher linear discrimination analysis，FLDA）對特征成分進行數據分析。建立了冰球子和毛慈菇HPLC指紋圖譜，分別匹配了46個和43個共有峰，共標示出17個色譜峰，指認出天麻素、loroglossin、dactylorhin A、白芨苷、山藥素III、白芨聯菲A、白芨聯菲B、卷瓣蘭蒽8個色譜峰并同時建立了上述除天麻素以外7個成分的HPLC含量測定方法。CA與PCA結果可將2種不同商品規格山慈菇樣品明顯區分。OPLS-DA分析結合含量測定Fisher判別分析結果表明，2種不同商品規格的山慈菇樣品間存在顯著性差異的5種成分是loroglossin、dactylorhin A、白芨苷、白芨聯菲B、卷瓣蘭蒽（＜0.001）。所建立的HPLC指紋圖譜結合CA、PCA、OPLS-DA分析及多成分含量測定能客觀、全面、有效地確定不同商品規格山慈菇中主要成分的差異，可為山慈菇質量評價體系的完善提供依據。

山慈菇；HPLC指紋圖譜；天麻素；loroglossin；dactylorhin A；白芨苷；山藥素III；白芨聯菲A；白芨聯菲B；卷瓣蘭蒽；化學計量學；質量評價

山慈菇來源于蘭科植物杜鵑蘭(D. Don) Makino、獨蒜蘭(Franch.) Rolfe或云南獨蒜蘭Rolfe的干燥假鱗莖，前者習稱“毛慈菇”，后二者習稱“冰球子”[1]。具有清熱解毒、消癰散結[2]的功效。現代研究表明，山慈菇主要含有糖苷類、菲類、聯芐類、多糖類及其他種類化學成分[3-10]，具有抗腫瘤[11]、抗菌[12]、抑制血管生成[13]和抗氧化[14]等藥理活性，常用于治療肝癌[15]、肺癌[16]和乳腺癌[17]等惡性腫瘤。其中糖苷類成分如天麻素[18]、白芨苷[19]等，菲類和聯芐類成分如山藥素III[20]、白芨聯菲A[21]等均具有良好的生物活性。

目前市場上山慈菇藥材質量參差不齊，價格差異懸殊，分為“冰球子”和“毛慈菇”2種商品規格，二者分別來源于獨蒜蘭屬和杜鵑蘭屬，形態差異明顯，可能存在內在成分差異。“冰球子”的價格常在1400～2800元/kg，而“毛慈菇”則在400～1600元/kg。《中國藥典》2020年版只包含性狀鑒別、顯微鑒別及檢查項，至今未見特征圖譜和含量測定項。近年來，有學者對山慈菇進行了指紋圖譜研究并結合含量測定評價藥材質量[22-27]，如采用HPLC法建立了山慈菇藥材指紋圖譜，對dactylorhin A、白芨苷和秋水仙堿進行了含量測定。但目前已建立的山慈菇指紋圖譜僅針對單一商品規格或藥材基原不明確，對不同商品規格山慈菇之間的內在成分差異研究未見報道；分離峰的數目較少，指認出的特征峰不夠全面。且僅以少數成分作為山慈菇含量測定指標，較難客觀全面地評價其質量，山慈菇質量評價研究總體不夠深入。

本研究以冰球子和毛慈菇2種商品規格的山慈菇樣品為研究對象，收集了多個主要產地的多批冰球子和毛慈菇樣本，擬建立不同商品規格山慈菇藥材的HPLC指紋圖譜。基于前期質譜研究鎖定了多類化學成分（糖苷類、2-異丁基蘋果酸酯類、2-異丁基酒石酸酯類、聯芐類、菲類）中的代表成分，擬同時對多種成分進行定量分析，并結合聚類分析（cluster analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）等化學計量學分析方法，篩選不同商品規格山慈菇藥材的差異成分，從化學成分的角度闡明兩者的質量特征，以期為山慈菇藥材質量控制體系的完善提供依據，為挖掘潛在的山慈菇質量標志物提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

對照品天麻素（批號A0138）、dactylorhin A（批號A1379）、白芨苷（批號A1378）、山藥素III（批號A1260）、白芨聯菲A（批號A1267）、白芨聯菲B（批號A1299）、卷瓣蘭蒽（批號A1301）均購自成都曼思特生物科技有限公司；loroglossin（批號PCS55129）購自成都植標化純生物技術有限公司。所用對照品質量分數均≥98%；乙腈（色譜純，美國飛世爾試劑公司），娃哈哈純凈水，其余均為分析純。

26批山慈菇樣品分別取自于貴州、云南、四川、廣西各地，詳細信息見表1，經北京中醫藥大學中藥鑒定學科石晉麗教授鑒定為蘭科植物杜鵑蘭(D. Don) Makino、獨蒜蘭(Franch.) Rolfe和云南獨蒜蘭Rolfe的干燥假鱗莖。

表1 26批山慈菇樣品來源信息

1.2 儀器

島津LC-20A型高效液相（日本島津公司）；Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱（美國安捷倫公司）；ME155DU型精密電子天平（十萬分之一，美國梅特勒-托利多公司）；KQ-500DV型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；600Y型高速多功能粉碎機（浙江西廚有限公司）；HH-8型數顯恒溫水浴鍋（常州越新儀器制造有限公司）；FD-1A-50型冷凍干燥機（北京博醫康儀器有限公司），RE-52AA型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化廠）。

2 方法與結果

2.1 提取方法考察

2.1.1 超聲提取 精密稱取山慈菇樣品MCG-1粉末（60目篩）2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入10倍量70%乙醇，超聲（功率1000 W、頻率40 Hz）處理60 min，連續超聲2次，靜置，濾過，合并濾液。減壓濃縮后，于冷凍干燥機中干燥至恒定質量，得山慈菇70%乙醇超聲提取物干膏（C1～C3）。

2.1.2 回流提取 精密稱取山慈菇樣品MCG-1粉末（60目篩）2 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入10倍量70%乙醇加熱回流提取，每次60 min，連續提取2次，靜置，濾過，合并濾液。減壓濃縮后，于冷凍干燥機中干燥至恒定質量，得山慈菇70%乙醇回流提取物干膏（H1～H3）。

2.1.3 超聲聯合回流提取 精密稱取山慈菇樣品 MCG-1粉末（60目篩）2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入10倍量70%乙醇，超聲（功率1 000 W、頻率40 Hz）處理60 min，靜置，濾過，殘渣再用10倍量70%乙醇加熱回流提取60 min，靜置，濾過，合并濾液。減壓濃縮后，于冷凍干燥機中干燥至恒定質量，得山慈菇70%乙醇超聲聯合回流提取物干膏（CH1～CH3）。

參考楊紅燕等[24]在HPLC指紋圖譜中應用的提取方法，考察不同提取方式對山慈菇藥材提取率的影響。單因素方差分析結果表明回流提取和超聲結合回流提取明顯優于超聲提取（＜0.05），但回流提取和超聲結合回流提取沒有統計學差異（＞0.05），故選擇回流提取為山慈菇提取方式，結果見表2。

表2 樣品不同提取方式下提取率比較

2.2 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B）；梯度洗脫條件：0～4 min，5% A；4～5 min，5%～20% A；5～35 min，20%～33% A；35～70 min，33%～52% A；70～72 min，52%～95% A；72～80 min，95% A；進樣體積10 μL；檢測波長200 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃。

2.3 提取條件優化

取山慈菇樣品MCG-1 9份，每份2 g，設定乙醇體積分數（A）、料液比（B）、提取時間（C）及提取次數（D）為試驗因素，每個因素設計3個水平，如表3所示。采用L9(34)正交表進行試驗，提取方法同“2.1.3”項下內容。

表3 正交試驗因素與水平

取各試驗所得干膏適量，精密稱定，配制成20 mg/mL溶液按按“2.2”項進行HPLC測定，以樣品提取率、HPLC色譜圖總峰面積為評價指標，通過極差分析得出對2個評價指標的影響因素排序分別為A＞B＞D＞C、A＞D＞B＞C，最佳設計分別為A1B3C2D3、A3B1C3D1，結合雙指標綜合平衡法得到最佳提取條件為70%乙醇回流提取2次，每次90 min，料液比為1∶20，結果如表4、5。

表4 L9(34)正交試驗結果(提取率)

表5 L9(34)正交試驗結果(總峰面積)

2.4 溶液的制備

2.4.1 混合對照品溶液的制備 取對照品天麻素、loroglossin、dactylorhin A、白芨苷、山藥素III、白芨聯菲A、白芨聯菲B、卷瓣蘭蒽適量，加入60%乙腈配制成質量濃度分別12.40、3.13、8.00、55.56、1.10、16.67、16.67、16.67 μg/mL的混合對照品溶液，保存于4 ℃冰箱備用。

2.4.2 供試品溶液的制備 精密稱取山慈菇各樣品粉末（60目篩）適量，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入20倍量70%乙醇加熱回流提取90 min，連續提取2次，靜置，濾過，合并濾液，于10 mL量瓶中定容，配成160 mg/mL（以生藥量計）溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，備用。

2.5 毛慈菇與冰球子樣品HPLC指紋圖譜研究

2.5.1 精密度試驗 取編號為BQZ-1和MCG-1的山慈菇樣品，按“2.4.2”項下條件制備供試品溶液，按“2.2”項分析，連續進樣6次，分別計算各共有峰的保留時間與峰面積。結果表明各共有峰保留時間的RSD＜0.8%，各共有峰峰面積的RSD＜1.9%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復性試驗 取編號為BQZ-1和MCG-1的山慈菇樣品，按“2.4.2”項下條件制備供試品溶液，按“2.2”項分析，平行進樣6次，分別計算各共有峰的保留時間與峰面積，結果表明各共有峰保留時間的RSD＜0.35%，各共有峰峰面積的RSD＜1.93%，表明本方法重復性良好。

2.5.3 穩定性試驗 取編號為BQZ-1和MCG-1的山慈菇樣品，按“2.4.2”項下條件制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，按“2.2”項分析，計算各共有峰的保留時間及峰面積。結果各共有峰的保留時間的RSD＜0.36%，各共有峰的峰面積的RSD＜1.9%。表明供試品在24 h內穩定。

2.5.4 指紋圖譜的建立及相似度評價 分別稱取26批山慈菇樣品適量，按“2.4.2”項下條件制備成山慈菇供試品溶液，按“2.2”項分析。將所得的樣品數據全譜按不同商品規格分別導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》軟件中，采用中位數法，時間窗口設定為0.1 min，分別選取BQZ-1和MCG-1作為參照圖譜，建立各個商品規格山慈菇的指紋圖譜，得到冰球子14批樣品指紋圖譜疊加圖、毛慈菇12批樣品指紋圖譜疊加圖及對照圖譜，見圖1、2。其中冰球子匹配了46個共有峰，毛慈菇匹配了43個共有峰，經與混合對照品的HPLC圖進行比較，共指認出天麻素、loroglossin、dactylorhin A、白芨苷、山藥素III、白芨聯菲A、白芨聯菲B、卷瓣蘭蒽8個色譜峰，通過與前期質譜研究和文獻數據[25-26]比對可確定蘋果酸、手參苷、手參苷II、1,4-di(4-β--glucopyrano- syloxybenzyl)-2-benzylmalate diester、shancigusin H、手參苷V、手參苷VI、手參苷IV、手參苷V異構體共9個色譜峰。

圖1 14批次冰球子和12批次毛慈菇HPLC指紋圖譜

1-蘋果酸 2-天麻素 3-loroglossin 4-dactylorhin A 5-手參苷 6-手參苷II 7-白芨苷 8-1,4-di(4-β-D-glucopyranosyl- oxybenzyl)-2-benzylmalate diester 9-shancigusin H 10-手參苷Ⅴ 11-手參苷VI 12-手參苷IV 13-手參苷V 異構體 14-山藥素III 15-白芨聯菲A 16-白芨聯菲B 17-卷瓣蘭蒽

利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》，以各商品規格山慈菇對照指紋圖譜作為參照圖譜，設其相似度為1.000，計算各個商品規格山慈菇的相似度，見表6。14批冰球子指紋圖譜相似度為0.986～0.997，12批毛慈菇指紋圖譜相似度為0.974～0.997。其中“毛慈菇”只有杜鵑蘭一種基原，表明該基原所含化學成分一致性較好，而“冰球子”規格下包括獨蒜蘭和云南獨蒜蘭2種基原，但其化學一致性仍然較好，可能是因為獨蒜蘭和云南獨蒜蘭屬于同屬植物，表明獨蒜蘭屬內化學成分差異較小。

2.6 冰球子和毛慈菇的化學模式識別

2.6.1 聚類分析（cluster analysis，CA） 將2種不同商品規格的26批山慈菇樣品中16個特征峰（峰2～17）的峰面積為變量（缺失色譜峰峰面積以0計），導入SPSS 21.0軟件，采用組間聯接和平方Euclidean距離作為分類依據進行系統聚類分析，探討不同商品規格山慈菇樣品成分含量的一致性，結果見圖3。當刻度距離為25時，26批山慈菇樣品聚為2類：MCG-1～MCG-12號樣品聚為第1類，BQZ-1～BQZ-14號樣品聚為第2類，表明毛慈菇和冰球子化學成分的含量有明顯差異，HPLC指紋圖譜結合聚類分析可以初步區分這2種商品規格的山慈菇樣品，但不同產地間區分不明顯。

表6 山慈菇樣品HPLC指紋圖譜相似度結果

圖3 不同商品規格山慈菇CA分析樹狀圖

2.6.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） PCA得分散點圖可以直觀顯示出不同樣品之間的整體差異性，反映數據的原始狀態，觀察到試驗樣品的自然分布和組別關系。采用SIMCA 14.1軟件，對山慈菇樣品中16個特征峰峰面積進行PCA分析，通過得分圖上樣品的聚散程度觀察不同商品規格樣品間的差異性趨勢。山慈菇樣品的Scores圖和Loading圖如圖4所示。建立的模型累計模型解釋率2cum為0.986，累計模型預測能力為0.796，表明建立的模型可以解釋98.6%的原始信息，且2cum和2cum均大于0.5，表明建立的模型良好，穩定可靠。由Scores圖可知，2種商品規格藥材分別聚集在2個不同的區域，說明兩者化學成分存在較大差異，可以得到較好地區分，與聚類結果基本一致。Loading圖中成分點距離原點越遠表明該成分對樣品的差異性貢獻越大，通過Loading圖可知，對p[1]（軸）的影響順序由大到小依次為峰4、11、8；對p[2]（軸）的影響順序由大到小依次為峰14、15、5。

2.6.3 正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA） 不同于PCA，OPLS-DA是一種有監督的判別分析統計方法，該方法基于OPLS，使分類信息主要集中在主成分上，建立樣品類別之間的關系模型，并且使模型易于解釋，其判別效果及主成分得分圖的可視化效果更加明顯。為進一步篩選對不同商品規格山慈菇藥材質量影響較大的成分，在PCA基礎上將其分為2組，以冰球子和毛慈菇指紋圖譜的16個特征峰峰面積為變量，利用SIMCA14.1軟件建立OPLS-DA模型。在OPLS-DA得分圖（2cum為0.69，2cum為0.973，2cum為0.966）中，14批冰球子及12批毛慈菇可很好地區分為2類，且相較與PCA區分度更大，如圖5-a所示，其中BQZ-8、9、10略微離群，可能是產地因素導致。生成的VIP圖如圖5-b所示。以變量重要性投影值（VIP）＞1.0為標準，共篩選出10個差異性標志物，為峰4、8、3、11、7、10、12、17、13、16，分別為dactylorhin A、1,4-di(4-β--glucopyranosyl-oxybenzyl)-2-benzyl- malate diester、loroglossin、手參苷VI、白芨苷、手參苷V、手參苷IV、卷瓣蘭蒽、手參苷V 異構體、白芨聯菲B，其中dactylorhin A的VIP值最大，說明毛慈菇和冰球子中dactylorhin A的含量差異最顯著。為防止模型出現過擬合，通過置換檢驗200次對模型內部進行驗證，結果如圖5-c，2、2回歸線的截距分別為0.114、?0.51，均小于原始值，證明模型穩定可靠，可用于2種商品規格山慈菇樣品的分析。

圖4 26批山慈菇PCA (a) 及16種成分PCA載荷圖(b)

圖5 26批山慈菇OPLS-DA得分圖(a)、16個成分VIP圖(b) 及OPLS-DA模型置換檢驗結果(c)

2.7 山慈菇中7種特征成分的HPLC含量測定

山慈菇的化學成分研究較少，目前認為其有效成分主要為菲類、聯芐類以及2-異丁基蘋果酸酯類成分。根據前期質譜研究結合文獻報道[25-26]分析，發現其含量較高的成分主要是2-異丁基蘋果酸酯類成分如 dactylorhin A、白芨苷、gymnoside等，2-異丁基酒石酸酯類成分如loroglossin、2-芐基蘋果酸酯類成分如1,4-di(4-β--glucopyranosyl- oxybenzyl) 2- benzylmalate diester等，以及菲類成分如白芨聯菲A、白芨聯菲B、卷瓣蘭蒽等，聯芐類成分如山藥素III等，且冰球子與毛慈菇上述成分含量差異較為明顯。本研究為比較山慈菇2種商品規格的化學成分差異，完善山慈菇藥材質量評價體系，根據其指紋圖譜中的化學成分特征以及可行性，選取loroglossin、dactylorhin A、白芨苷、山藥素III、白芨聯菲A、白芨聯菲B、卷瓣蘭蒽7個代表性成分建立含量測定方法。

2.7.1 線性關系考察 精密吸取loroglossin、dactylorhin A、白芨苷、山藥素III、白芨聯菲A、白芨聯菲B、卷瓣蘭蒽對照品儲備液適量，按倍比稀釋的方法稀釋成不同質量濃度的對照品溶液。按照“2.2”項下色譜條件進行測定。以峰面積為縱坐標（），質量濃度為橫坐標（）繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數（2），同時進行檢測限（/＝3）和定量限（/＝10）的測定，結果見表7，各成分在質量濃度范圍內線性關系良好。

表7 標準曲線回歸方程

2.7.2 精密度試驗 取編號為BQZ-1和MCG-1的山慈菇樣品，按“2.4.2”項下條件制備供試品溶液，按“2.2”項分析，連續進樣6次，分別計算各待測峰的保留時間與峰面積。結果表明各待測峰保留時間的RSD＜0.05%，峰面積的RSD＜2.5%，表明儀器精密度良好。

2.7.3 重復性試驗 取編號為BQZ-1和MCG-1的山慈菇樣品，按“2.4.2”項下條件制備供試品溶液，按“2.2”項分析，分別計算各待測峰的保留時間與峰面積，結果表明各待測峰保留時間的RSD＜0.1%，峰面積的RSD＜2.43%，表明本方法重復性良好。

2.7.4 穩定性試驗 取編號為BQZ-1和MCG-1的山慈菇樣品，按“2.4.2”項下條件制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、16、24 h進樣，按“2.2”項分析，計算各待測峰的保留時間及峰面積。結果各待測峰的保留時間的RSD＜0.3%，峰面積的RSD＜3.0%。表明供試品在24 h內穩定。

2.7.5 加樣回收率試驗 取編號為BQZ-1和MCG-1的山慈菇樣品各6份，每份0.4 g，以近1∶1的比例加入相應化學成分的對照品，于5 mL量瓶中用60%乙腈定容，配制成80 mg/g（以生藥量計）的溶液，按“2.2”項分析，分別記錄各成分峰的保留時間與峰面積，計算各成分的加標回收率和RSD值。冰球子和毛慈菇的各待測成分平均加樣回收率分別為99.20%～103.15%和98.43%～102.25%，RSD分別為0.57%～1.64%和0.52%～1.73%，表明方法的準確度良好。

2.7.6 樣品測定 取14批冰球子樣品和12批毛慈菇樣品，按“2.4.2”項下條件制備供試品溶液，按“2.2”項分析，根據各成分最適宜檢測波長，分別在230 nm（loroglossin）、220 nm（dactylorhin A）、224 nm（白芨苷）、270 nm（山藥素III、白芨聯菲A）、320 nm（白芨聯菲B、卷瓣蘭蒽）下進行檢測，得到待測成分峰面積，計算樣品含量，見表8。根據各指標成分含量測定結果柱形圖可以明確不同商品規格山慈菇中差異性指標成分，見圖6。

2.7.7 Fisher線性判別（fisher linear discrimination analysis，FLDA） 利用SPSS 21.0統計軟件的Fisher線性判別分析驗證OPLS-DA中VIP大于1.0的5個指標成分作為不同商品規格山慈菇識別的適用性，將BQZ-1、5、8、11及MCG-1、4、7、10號樣品設為驗證集，其余樣品均為訓練集。將訓練集樣本按照商品規格進行分組建模，以loroglossin（a）、dactylorhin A（b）、白芨苷（c）、白芨聯菲B（f）、卷瓣蘭蒽（g）作為判別變量，建立判別函數（discriminant function，DF），DFBQZ＝?43.839＋0.030a＋0.029b＋0.003c＋0.758f?2.545g，DFMCG＝?53.319＋0.153a＋0.007b＋1.959f?6.595g，組質心處的函數分別為?5.268、5.926，且判別函數的Lambda檢驗顯著性均小于0.05。由訓練集樣本自身驗證及驗證集驗證，樣本總正確判別率均為100%。表明loroglossin、dactylorhin A、白芨苷、白芨聯菲B、卷瓣蘭蒽可以作為山慈菇商品規格區分的指標成分。

表8 26批山慈菇樣品含量測定

A-loroglossin B-dactylorhin A C-白芨苷 D-山藥素III E-白芨聯菲A F-白芨聯菲B G-卷瓣蘭蒽 ***P＜0.001

3 討論

3.1 提取方法考察及提取條件優化

本實驗考察了提取方法（超聲提取、回流提取、超聲結合回流提取）對山慈菇藥材提取率的影響，并基于正交實驗優化了提取條件（乙醇體積分數、料液比、提取時間、提取次數）。文獻中山慈菇藥材的提取常采用甲醇超聲法[25]。本研究前期比較相同比例的甲醇-水、乙醇-水超聲提取，發現二者并無明顯差異，考慮到山慈菇藥材主要的有效成分類型為菲類、聯芐類及異丁基蘋果酸酯類成分等，而乙醇的極性較甲醇小，對有效成分的提取可能更為完全，且乙醇較甲醇毒性小，故選擇乙醇-水作為提取溶劑進行下一步的考察。

本研究通過正交試驗雙指標綜合平衡法，基于提取率和總峰面積2個指標進行極差分析。以提取率為指標評價時，乙醇體積分數對指標的差異貢獻最高，其次是料液比、回流次數、回流時間，其中在60%乙醇、1∶30、60 min、3次條件下提取率最高。以總峰面積為評價指標時，乙醇體積分數對指標的差異貢獻最高，其次是回流次數、料液比、回流時間，其中在80%乙醇、1∶10、90 min、1次條件下總峰面積最大。綜合各因素各水平對兩個指標的差異貢獻，最終確定最佳提取條件為：70%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶20、回流提取2次，每次90 min。

3.2 色譜條件的優化

本研究前期基于楊紅燕等[24]研究對HPLC洗脫梯度、柱溫、流速進行優化，實驗中通過HPLC指認出天麻素、loroglossin、dactylorhin A、白芨苷、山藥素III、白芨聯菲A、白芨聯菲B、卷瓣蘭蒽等山慈菇中含量較高的代表性成分，并采用PDA檢測器對山慈菇供試品溶液進行190～400 nm全波長掃描，各類成分在190～210 nm吸收均較高，綜合基線、峰形及分離度等因素，選取200 nm作為HPLC指紋圖譜的檢測波長，并選擇230 nm（loroglossin）、220 nm（dactylorhin A）、224 nm（白芨苷）、270 nm（山藥素III、卷瓣蘭蒽）、320 nm（白芨聯菲A、白芨聯菲B）作為含量測定的專屬檢測波長，最大程度地減少對成分含量測定的影響。

3.3 指紋圖譜及化學計量學分析

本研究采用相似度評價、CA、PCA和OPLS-DA等方法對多批次不同商品規格山慈菇藥材指紋圖譜進行全面、客觀的評價，成功區分了冰球子和毛慈菇并挖掘出二者的差異性成分；利用Fisher線性判別分析驗證所選的特征成分作為不同商品規格山慈菇識別指標的適用性，為山慈菇藥材的質量評價指標的選擇提供了依據。2個商品規格內部指紋圖譜的相似度均大于0.9，但不同商品規格間相似度有所區別，表明不同商品規格藥材間化學成分存在一定的差異。化學計量學分析結果也可將兩者明顯區分，其中BQZ-8、BQZ-9、BQZ-10在PCA和OPLS-DA中略有離群，可能是由于這3個產于云南麗江的樣品中白芨苷、山藥素III含量較其他產地更高，這種含量差異可能與藥材生長環境、采收時間等有關。最后從標示出的16個特征峰中以OPLS-DA模型的VIP值大于1進行2種商品規格的差異成分篩選，得到了dactylorhin A、1,4-di(4-β--glucopyrano- syloxybenzyl)-2-benzylmalate diester、loroglossin、手參苷VI、白芨苷、手參苷V、手參苷IV、卷瓣蘭蒽、手參苷V 異構體、白芨聯菲B10個成分。該結果與PCA載荷圖基本一致，說明這些成分可能是不同商品規格山慈菇藥材中的差異性指標成分。

3.4 多成分含量測定

迄今為止，山慈菇的質量控制指標性成分暫不明確，質量評價體系尚未完善。因此尋找山慈菇藥材中差異性成分并建立相應的含量測定方法對山慈菇質量控制具有非常重要的意義。

本研究收集了山慈菇4個主要產地的26批樣品，以不同商品規格分類，選取7個特征性成分同時進行含量測定。經正態分布檢驗和方差齊性檢驗，發現白芨苷含量符合正態分布，方差齊，故采用獨立樣本檢驗，具有極顯著性差異（＜0.001）；loroglossin、山藥素III含量符合正態分布，方差不齊，采用單樣本檢驗，loroglossin具有極顯著性差異（＜0.001），山藥素III有差異趨勢，但無顯著性（＞0.05）；dactylorhin A、白芨聯菲A、白芨聯菲B、卷瓣蘭蒽不符合正態分布，采用非參數檢驗（Mann-Whitney U），結果其均具有極顯著性差異（＜0.001）。通過Fisher線性判別分析，分別構建了冰球子和毛慈菇的判別函數，由訓練集樣本自身驗證及驗證集驗證，樣本總正確判別率為100%。說明所選的5種有效成分可作為指標成分用于鑒別兩種不同商品規格山慈菇樣品，為山慈菇真偽鑒別提供了參考。

另外，峰1-蘋果酸和峰2-天麻素作為山慈菇中異丁基蘋果酸酯類成分的結構單元，也具有一定的研究價值，但是二者極性較大，出峰過早，容易受到溶劑效應的影響，較難在C18柱中對其他小極性特征成分定量的同時兼顧，更好的定量方法有待研究。本研究建立了不同商品規格山慈菇藥材的HPLC指紋圖譜，指認出山慈菇中17種特征成分峰，并基于除蘋果酸以外的16種特征成分的峰面積通過化學計量學分析成功區分了2種不同商品規格的山慈菇樣品，通過OPLS-DA模型VIP值篩選出了10個差異性標志物；建立了同時測定7種特征成分的含量測定方法，并結合VIP值最終篩選出5種含量具有極顯著差異的差異性標志物（loroglossin、dactylorhin A、白芨苷、白芨聯菲B、卷瓣蘭蒽），對冰球子與毛慈菇的化學成分差異做出了較為全面的分析。結果表明兩者在成分的種類和含量上存在明顯的差異。該研究可為不同商品規格山慈菇藥材的質量評價提供參考，為山慈菇藥材整體質量控制體系的完善提供數據支撐。然而，本研究還存在一些不足：第一，主要探究了不同商品規格藥材間的差異性，但從化學計量學分析結果可以看出，不同產地樣品間也存在一定差異，但本實驗各產地樣品批次較少，接下來可收集更多批次不同產地的樣品，考察產地因素對其化學成分的影響。第二，手參苷類成分在山慈菇中含量較高，是山慈菇中比較重要的一類化學成分，但由于其對照品不易獲得，無法對此類化學成分進行定量分析，后期可通過分離純化制備此類成分單體，進行深入研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 34.

[2] 宋·掌禹錫等撰, 尚志鈞輯復. 嘉祐本草輯復本 [M]. 北京: 中醫古籍出版社, 2009: 73.

[3] 司函瑞, 陳小玲, 付東興, 等. 山慈菇的化學成分研究 [J]. 特產研究, 2021, 43(6): 136-140.

[4] 原文珂, 覃彬華, 李小平, 等. 山慈菇的化學成分研究 [J]. 中國現代中藥, 2017, 19(5): 639-641.

[5] 李小平. 杜鵑蘭化學成分研究 [D]. 武漢: 中南民族大學, 2016.

[6] 董海玲, 郭順星, 王春蘭, 等. 山慈菇的化學成分和藥理作用研究進展 [J]. 中草藥, 2007, 38(11): 1734-1738.

[7] 王超. 獨蒜蘭乙酸乙酯部位的化學成分研究 [D]. 北京: 北京協和醫學院, 2014.

[8] Wu X Q, Li W, Chen J X,. Chemical constituents and biological activity profiles on(Orchidaceae) [J]., 2019, 24(17): 3195.

[9] Liu X Q, Yuan Q Y, Guo Y Q. Two new stilbenoids from[J]., 2009, 11(2): 116-121.

[10] Xue Z, Li S, Wang S J,. Mono-, Bi-, and triphenanthrenes from the tubers of[J]., 2006, 69(6): 907-913.

[11] 張楠, 曹曉東, 劉穎, 等. 山慈菇酯提物對4T1乳腺癌免疫微環境的影響 [J]. 科學技術與工程, 2021, 21(10): 3940-3949.

[12] 余怡欣, 陳龍惠, 曹丹, 等. 山慈菇活性成分微波提取工藝優化、指紋圖譜與抗植物病菌活性分析 [J/OL]. 食品工業科技. 2023, 44(5): 204-212.

[13] 李雪蓮, 李智, 黃芊, 等. 山慈菇介導VEGF-A血管生成抑制乳腺癌細胞上皮-間質轉化的實驗研究 [J]. 中國醫師雜志, 2019, 21(11): 1658-1662.

[14] 房宇坤, 寧安紅, 劉磊, 等. 山慈菇多糖的提取及其抗氧化作用的研究 [J]. 大連醫科大學學報, 2017, 39(6): 527-531.

[15] 孫玉莉, 王偉芹, 孫建光, 等. 尹常健教授治療原發性肝癌臨證用藥特點 [J]. 中西醫結合肝病雜志, 2020, 30(5): 448-449.

[16] 李楊枝, 章程, 徐超, 等. 基于文獻探討國醫大師辨治肺癌的經驗總結 [J]. 中醫腫瘤學雜志, 2022, 4(2): 69-73.

[17] 宋敬茹, 孫明瑜. 國醫大師劉嘉湘扶正法辨治乳腺癌術后經驗 [J]. 中華中醫藥雜志, 2022, 37(4): 2020-2024.

[18] Liu S B, Yang S T. Cardiovascular protective properties of gastrodin [J]., 2022, 12(4): 141.

[19] Tian S X, Cheng W, Lu J J,. Role of militarine in PM2.5-induced BV-2 cell damage [J]., 2021, 46(6): 1423-1434.

[20] Hasriadi, Wasana P W D, Sritularak B,. Batatasin III, a constituent of, improves murine pain-like behaviors with a favorable CNS safety profile [J]., 2022, 85(7): 1816-1825.

[21] Yan X M, Tang B X, Liu M F. Phenanthrenes fromandevaluation of their antibacterial and anti-haemolytic properties [J]., 2018, 32(6): 707-710.

[22] 崔保松, 宋杰, 李帥, 等. RP-HPLC同時測定山慈菇藥材中dactylorhin A和militarine的含量 [J]. 中國中藥雜志, 2013, 38(24): 4347-4350.

[23] 呂林鋒, 蔣永海, 朱希, 等. 山慈菇HPLC指紋圖譜質量評價 [J]. 中國現代應用藥學, 2016, 33(10): 1276-1280.

[24] 楊紅燕, 項微微, 李玲燕. HPLC法指紋圖譜在山慈菇真偽鑒別中的應用 [J]. 浙江中醫雜志, 2020, 55(1): 72-73.

[25] 王靜, 肖秋肖, 周祖英, 等. 基原為云南獨蒜蘭的山慈菇的化學成分鑒定與分析 [J]. 中國藥房, 2022, 33(10): 1165-1171.

[26] 司函瑞. 山慈菇的化學成分及抗肝癌作用的研究 [D]. 長春: 吉林大學, 2022.

[27] 謝典, 朱聰, 潘紅波, 等. HPLC法同時測定山慈菇中3種成分 [J]. 中成藥, 2022, 44(6): 2050-2053.

Quality differences of different commercial specifications ofbased on HPLC fingerprint, multi-index component determination and chemometrics

HAO Zhuang-zhuang1, CAO Yu-xin1, LIU Meng-meng1, XUE Jing-wen1, ZHANG Ge1, LU Yi-fan1, FAN Wen-xin1, ZHOU ying3, FENG Liang4, WANG Chun-guo2, SHI Jin-li1

1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China 2. Research Institute of Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China 3. Gaobeidian Community Health Service Center, Chaoyang District, Beijing 100124, China 4. Wangjing Community Health Service Center, Chaoyang District, Beijing 100102, China

To establish the HPLC fingerprint of(Shancigu), determine the content of its characteristic components, and analyze the difference of the chemical components of the different commercial specifications (BingqiuziandMaocigu) of Shancigu combined with a variety of chemometrics analyses to provide a reference for its quality control.The extraction method of Shancigu was optimized. HPLC was used to establish the fingerprint of BingqiuziandMaocigu respectively, and the content of characteristic components was determined. The data of characteristic components were analyzed by similarity evaluation, cluster analysis (CA), principal component analysis (PCA), orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) and Fisher linear discriminant analysis (FLDA).HPLC fingerprints of Bingqiuzi and Maocigu were established, and a total of 46 and 43 common peaks were matched in Bingqiuzi and Maocigu respectively, 17 chromatographic peaks were calibrated, and eight chromatographic peaks were identified, including gastrodin, loroglossin, dactylorhin A, militarine, batatasin III, blestriarene A, blestriarene B, monbarbatain A, and HPLC method for the determination of the above seven components except gastrodin was established simultaneously. The results of CA and PCA can distinguish two kinds of samples of different commercial specifications. The results of OPLS-DA analysis combined with content determination Fisher discriminant analysis showed that loroglossin, dactylorhin A, militarine, blestriarene B, and monbarbatain A (< 0.001) were the components with significant differences between the samples of two different commodity specifications.The HPLC fingerprint of Shancigu combined with CA, PCA, OPLS-DA analysis and multi-component content determination, can determine the differences of the main components in different commercial specifications of Shancigu objectively, comprehensively and effectively, and provide a basis for the improvement of the quality evaluation system of Shancigu.

(shancigu); HPLC fingerprint; gastrodin; loroglossin; dactylorhin A; militarine; batatasin III; blestriarene A; blestriarene B; monbarbatain A; chemometrics; quality evaluation

R286.2

A

0253 - 2670(2023)06 - 1935 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.026

2022-07-09

國家自然科學基金資助項目（82073971）

郝壯壯，男，碩士研究生，研究方向為中藥藥效物質基礎。E-mail: bucmhzz@126.com

王春國，實驗師，從事中藥藥效物質基礎研究。E-mail: wangcg1119@126.com

石晉麗，博士生導師，教授，從事中藥藥效物質基礎與作用機制研究。E-mail: shijl@vip.sina.com

#共同第一作者：曹宇欣，女，博士研究生，研究方向為中藥藥效物質基礎與作用機制。E-mail: 18835196398@163.com

[責任編輯 時圣明]