豬圓環(huán)病毒病的流行病學與實驗室診斷技術

張洪鋼，李志美

（山東省諸城市畜牧業(yè)發(fā)展中心 山東濰坊 262200）

隨著我國經(jīng)濟水平的不斷提高，國民對于豬肉及其相關制品也提出了新的要求，健康養(yǎng)殖成為當前生豬養(yǎng)殖業(yè)必然的發(fā)展方向，因此做好生豬養(yǎng)殖過程中各類疫病的防控工作極為重要。豬圓環(huán)病毒病是由于生豬感染豬圓環(huán)病毒后引發(fā)的一類豬多系統(tǒng)功能障礙性疾病，主要引發(fā)患病豬只體質明顯下降、腹瀉、呼吸困難以及消瘦衰弱等情況，該病是繼豬藍耳病后的又一豬類重要傳染性疫病，是全球公認的可對生豬養(yǎng)殖業(yè)造成危害的重要疫病，被我國列為二類動物疫病。近年來，隨著外來豬種的不斷增加，該病的感染率與發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，豬圓環(huán)病毒主要引起生豬機體的免疫抑制以及嚴重的呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)損傷，可導致患豬的飼料轉化率降低、生育繁殖能力受到影響和較高的死亡率，給養(yǎng)殖戶帶來嚴重的經(jīng)濟損失。了解豬圓環(huán)病毒的流行特點，做好該病的預防工作，對豬場內的患豬及時做出診斷、治療，對降低該病造成的損失具有重要意義。

1 豬圓環(huán)病毒病的病原學分析

豬圓環(huán)病毒（PCV）是本病的主要致病原，該病毒是一種單股的DNA 病毒，屬于圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬，當前已發(fā)現(xiàn)有4 種亞型，其中PCV1 不具有致病性，PCV2 和PCV3 具有致病性，目前尚未確定PCV4 是否能夠致病。豬圓環(huán)病毒病主要是由PCV2 導致的，該病毒沒有囊膜和血凝性，外形呈現(xiàn)20 面體對稱，病毒粒子的直徑在12～23nm 之間，是最小的動物病毒之一。豬圓環(huán)病毒對酸性和高溫環(huán)境的耐受性較強，可以在pH 值為3 的酸性環(huán)境中保持活性，在75℃的環(huán)境下加熱15min 后仍具有活性，同時也對碘酒和氯仿等消毒制劑具有較強的抵抗力，但豬圓環(huán)病毒對戊二醛等氧化劑比較敏感，具有較好的殺菌效果。

2 流行病學分析

豬圓環(huán)病毒病的流行范圍比較廣泛，可在全球范圍內流行，豬是PCV2 的自然宿主，尚未發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒對其他動物以及人類的感染報道。該病無季節(jié)特征，一年四季均可感染發(fā)病，并且任何日齡的生豬均對本病易感，但對哺乳期及保育期的仔豬危害更嚴重，尤其5～8 周齡的仔豬多見，通常仔豬斷奶后的2～3d 或1 周內開始發(fā)病，成年豬則呈亞臨床經(jīng)過。該病主要通過接觸傳播，可通過消化道和呼吸道進行水平傳播，也可以通過配種、胎盤或者胚胎移植等途徑垂直傳播給仔豬，患病豬只以及隱性感染的生豬是該病的主要傳染源，其次，健康豬只接觸到被豬圓環(huán)病毒污染的人、動物、器具、設備或者車輛等也可以導致其直接或者間接的感染。豬群感染該病后的發(fā)病率為20%～60%左右，死亡率約為5%～35%，有時也可達到50%。誘發(fā)豬圓環(huán)病毒病的原因較多，PCV2 感染并不是唯一的病因，外界環(huán)境、溫度、飼料、免疫、應激因素或者發(fā)生協(xié)同感染后均可誘導該病發(fā)生。

3 實驗室診斷技術

3.1 病毒分離鑒定試驗

無菌條件下采集病死患豬的肺臟或者淋巴結等器官組織，研磨后制成混懸液，然后在-20℃的環(huán)境下反復凍融、離心，取出上清液后使用過濾器除菌，然后將其接種到已經(jīng)長成單層并且未被PCV 污染的PK-15 細胞中，在37℃的環(huán)境下培養(yǎng)24h，此后將細胞培養(yǎng)液倒掉加入無菌PBS 進行洗滌，待清洗干凈后加入濃度為2%胎牛血清的DMEM 細胞維持液，再在37℃的環(huán)境下繼續(xù)孵育48～72h，待連續(xù)盲傳3 代后，可對其進行豬圓環(huán)病毒抗原或者核酸檢測。該分離鑒定方法比較耗費時間，不適用于養(yǎng)殖場內疾病的快速診斷[1]。

3.2 血清學檢測技術

1）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。ELISA 檢測方法的原理首先是將豬圓環(huán)病毒的抗原或者抗體吸附到固相載體上，然后對其進行免疫酶染色，待底物顯色后可以使用酶標儀測定或者肉眼直接觀察結果的一種檢測方法。這種檢測方法具有敏感性強、檢測速度快以及特異性高等特點，并且可以用于一次性大批量的檢測樣品，是當前實驗室檢測應用最為廣泛的，也是發(fā)展最快的診斷方法之一。在實際檢測中可在無菌條件下采集患豬或者病死豬的血液，制備成血清后使用豬圓環(huán)病毒病ELISA 診斷試劑盒，按照說明書進行相關的實驗操作，待底物顯色后使用酶標儀，選擇630nm 的波長測定反應物的OD 值，如果OD 值大于0.4，則該樣本為陽性，如果檢測值在0.2～0.4 之間，則將其判定為可疑樣本，如果OD 值小于0.2，則可判定樣本為陰性。

2）競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗（C-ELISA）。2000 年，Walker 等[2]利用細胞培養(yǎng)的PCV2 作為抗原，同時使用PCV2 的特異性單克隆抗體作為競爭試劑，建立了C-ELISA 檢測方法，實踐表明這種檢測方法具有較高的檢出率，可高達99.58%，明顯高于間接免疫熒光法（IFA）的檢出率（97.14%），較免疫熒光法檢測方法更為敏感，并且其可用于大批量的豬圓環(huán)病毒檢測。

3）間接免疫熒光試驗（IFA）。該試驗方法屬于特異性的血清學診斷方法，主要是對豬圓環(huán)病毒分離效果的鑒定以及對患豬病變組織的檢測或者豬源細胞的豬圓環(huán)病毒感染情況等，既可以用于檢測群特異性抗原，又可以用于檢測型特異性抗原。在實際診斷中可將采集的患豬病料接種PK-15 細胞，或者將病變的組織直接冰凍切片后，使用丙酮進行固定，然后再使用兔抗高免血清和細胞培養(yǎng)物進行反應，同時設置一組沒有被豬圓環(huán)病毒感染的正常的PK-15 細胞，或者正常的組織制備成切片作為對照組，即可對豬圓環(huán)病毒進行相應的檢測及定型。若在對細胞或者切片鏡檢時出現(xiàn)了特異性的熒光反應，則可以說明該病料中存在豬圓環(huán)病毒，即可將其判定為陽性。IFA 檢測法操作較為簡單、快速，并且這種方法的花費較小，在實驗室診斷當中也較為常用。

4）免疫膠體金技術（ICGT）。這種檢測方法將紅色膠體金作為標記物，使用微孔濾膜作為載體，經(jīng)過3～5min 的滲濾反應，逐步完成整個反應過程。經(jīng)ELISA 法驗證后表明這種檢測方法具有較強的蛋白免疫原性，可以準確地鑒別出PCV2 的陽性血清以及標準的陰性血清，并且與豬的其他病毒血清沒有免疫交叉反應，ICGT 的檢測靈敏度和ELISA 法較為相似。

5）免疫過氧化物酶單層細胞試驗（IPMA）。IPMA 檢測方法是通過在96 孔板上長有PCV 的PK-15 單層細胞上，加入1:10 稀釋后的待檢測的豬血清，待反應一段時間后將其吸干、洗滌，然后加入經(jīng)辣根過氧化物酶（HRP）標記的豬IgG 抗體，在37℃的環(huán)境中孵育30min，再次吸干、洗滌，然后加入底物溶液進行顯色反應，最后終止反應即可對血清中的抗體進行檢測。利用這種檢測方法對PCV2 的檢出率較高，可達80.5%左右。經(jīng)過后期的不斷改進，IPMA抗體檢測試劑盒可以更加快速、簡便的檢測出PCV2，并且具有較高的特異性和敏感性[3]。

3.3 分子生物學診斷技術

1）常規(guī)PCR 技術。常規(guī)PCR 技術是通過參照PCV2 的基因序列，設計出特異性的PCV2 引物，將患病豬只病料中的PCV2 基因進行擴增，最終根據(jù)擴增產(chǎn)物判斷出該病料中是否具有豬圓環(huán)病毒。這種檢測方法操作簡便、快速、特異性強，并且敏感性較高，在實驗室診斷當中應用較為廣泛。

2）套式PCR 技術。套式PCR 技術有效解決了病料組織或者細胞當中PCV2 的濃度太低，使用常規(guī)PCR 技術不能準確檢測到PCV2 基因組的缺點。這種檢測PCV2 的方法較常規(guī)PCR 技術具有更高的敏感性。

3）熒光定量PCR 技術（RT-PCR）。這種檢測方法是在常規(guī)的PCK 體系中加入熒光基團，通過實時監(jiān)測熒光信號的積累對整個的PCR 進程進行監(jiān)測，最后再利用標準曲線對未知的模板定量分析。RT-PCR 檢測法具有較高的靈敏度和特異性，并且檢測的穩(wěn)定性較好，比傳統(tǒng)PCR 技術檢出的陽性率高出14.3%，已經(jīng)逐步替代傳統(tǒng)PCR 檢測技術，成為實驗室常用的病原微生物診斷技術。

4）PCR 限制性片段長度多態(tài)性分析法（PCR-RFLP）。該方法屬于多態(tài)性分析法，充分考慮到了生物在進化過程中，由于基因序列的改變而導致的限制性核酸內切酶的識別位點的改變，通過不同豬圓環(huán)病毒毒株間酶切位點及其保守性的差異，區(qū)分出不同地區(qū)來源的病毒毒株。

5）原位雜交技術（ISH）。這種檢測方法是由細胞學、分子生物學以及組織化學相結合所組成的檢測技術，主要利用堿基互補順序的特點，通過堿基互補形成穩(wěn)定的雜交雙鏈，其敏感性較強，可以準確定位到位PCV、PCV 及豬藍耳病病毒DNA 或RNA 在細胞中的部位[1]。

6）基因芯片檢測技術。該檢測方法是由微電子學以及分子生物學等多個學科相結合形成的高科技檢測技術，可以準確地鑒別出豬圓環(huán)病毒的基因型，同時還能鑒別出豬瘟病毒和豬藍耳病病毒的感染，具有靈敏度高、特異性強以及可重復的特點。

4 結語

綜上所述，豬圓環(huán)病毒病對生豬養(yǎng)殖業(yè)的危害巨大，飼養(yǎng)人員深入了解豬圓環(huán)病毒病的流行特點，并結合實際情況選擇適宜的診斷技術及時對本病做出確診，對有效防護該病的蔓延和傳播具有重要的意義。