缺氧誘導因子-1α在滲出性老年性黃斑變性中的研究進展*

梁慧穎，曹明芳

1 福建中醫藥大學 福建福州 350122

2 福建中醫藥大學附屬人民醫院 福建福州 350004

我國自2000年正式從成年型轉向人口老齡化社會以來[1]，各種與老齡化相關的疾病隨之而來，包含現階段全球三大致盲疾病之一的老年性黃斑變性（agerelated macular degeneration，AMD）[2]。因 此，AMD已經成為導致我國中老年人視覺功能下降的最大障礙之一。滲出性老年性黃斑變性（exudative senile macular degeneration，ESMD）的患病人數僅占AMD患病人數總數的10%～15%[3]，但卻是可以導致患者視力嚴重下降并最終完全喪失視力的一種亞型。脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）生長引起的眼底出血、滲出性病灶和黃斑水腫是滲出性老年性黃斑變性的特征性病理表現[4]，也是導致ESMD患者視力損害的主要原因。

相關臨床研究證據及動物實驗數據顯示，ESMD患者Bruch膜發生變性導致代謝產物發生異常堆積，使得視網膜RPE層得不到脈絡膜毛細血管的血液滋養，導致ESMD患者視網膜的血氧供應與其他年齡相仿者相比顯著降低[5]。因此，視網膜組織處于缺氧狀態。缺氧誘導因子-1α （ hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）作為在缺氧狀態下活躍的介導缺氧相關反應的代表性轉錄激活因子，由其上游的VHL蛋白（von hippel-lindau protein，pVHL）/輔氨酰羥化酶（prolyl hydroxylases，PHDs）以及p42/p44 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K） /蛋白激酶 B（ protein kinase B，PKB/AKT） /哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）等信號通路誘導激活[6]，進而能夠與HIF-1α下游眾多的促進血管新生的生長因子的特異性缺氧反應元件區域結合，達到血管新生而恢復必需供氧量的目的，這可能是CNV形成的關鍵病因。CNV的形成是ESMD發生的重要標志。

缺氧誘導因子-1α的結構及生物學功能

1 缺氧誘導因子-1α的結構

缺氧誘導因子-1在90年代由Wang等從人肝癌細胞培養中發現，其本質是一種多功能的轉錄因子[7]。它由α亞基和β亞基構成，其中，HIF-1α主要負責調節HIF-1的活性及功能，HIF-1β則負責保持結構的穩定性。HIF-1α是迄今為止在哺乳動物中發現的唯一在缺氧環境中被激活并發揮作用的轉錄因子，它在缺氧條件下可以通過轉錄激活下游相關細胞因子維持機體穩定還可以通過自身的活化控制疾病的發生與發展[8]。

HIF-1與HIF-2和HIF-3組成一個家族，統稱為HIFs。其中HIF-1α是最重要的調節氧分壓的亞單位。HIF-1α屬于bHLH/PAS蛋白家族，以具有DrosophilaPer 、Human ARNT及Drosophila Sim結構為特征，統稱為PAS結構域，并可調節多種生理功能、生長發育，包括神經發育和缺氧[9]。HIF-1α的N端部分包含一個與特定DNA結合的bHLH核心結構，其下游部分Pro/Ser/Thr，即脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸，是形成二聚體的特定部分[10]。C端部分包含三個結構域：反式激活域-C（TAD-C）、反式激活域-N（TAD-N）和氧依賴降解域（ODD）[11]。TAD能使HIF-1α被激活，依賴氧的ODD區因含有豐富的Pro/Ser/Thr，故能通過泛素化通路使HIF-1α降解，從而失掉活性。HIF-1α的N端的結構域可幫助其維持穩定的二聚體形態，而與下游的缺氧反應元件HRE結合方可發揮其轉錄功能[12]。

2 缺氧誘導因子-1α的生物學功能

關于HIF-1α的生物學功能，主要通過氧濃度變化以及HIF-1α蛋白自身的羥基化、乙酰化、磷酸化的調控、輔助來實現。在常氧狀態下，HIF-1α的半衰期在正常氧濃度下＜5 min，它在人或哺乳動物體內幾乎無法檢測到。機體處于非缺氧狀態下時HIF-1α可經由泛素蛋白酶體的途徑的泛素化作用，導致HIF-1α降解以達到阻止其轉錄激活的目的。這是由于C末端的ODD區含有兩個輔氨酸殘基：Pro402及Pro564可以促進HIF-1α與pVHL的結合，故細胞漿內的氧感受器——PHDs，可以使ODD區的脯氨酸殘基可發揮其羥化作用以達到以上結合[13]。而缺氧狀態下，HIF-1α的C末端的天冬氨酸殘基可通過HIF-1α的抑制劑FIH-1使HIF-1α與CREB結合蛋白的結合被阻斷，進而使得HIF-1α穩定表達并與HIF-1β結合，通過轉位進入細胞核形成異源二聚體。最終功能可與HRE，即缺氧反應元件的基因序列結合。HRE由于其自身的結構特點上具有高度可變的測序基因，故可以使組織或細胞的缺氧及反應特異性增強[14]。由于HRE的高度可變性，使得HIF-1α能夠調節的靶基因種類增多，包含血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）、血管生成素（angiopoietin，Ang）、胎盤生長因子（placental growth factor，PLGF）、基質細胞衍生因子-1（stromal cellderived factor-1，SDF-1）等。

HIF-1α在ESMD發病中所起的作用

無論是外界刺激抑或是機體自身病理過程導致的缺氧，均可引起HIF-1α的穩定表達。缺氧所誘導的上游信號通路通過調控HIF-1α蛋白活性，使機體對局部組織缺氧作出相應的代償性反應，從而引起一系列HIF-1α下游與促進血管新生相關的因子表達水平升高，并將缺氧信號傳入眼內細胞，促使CNV的形成，導致ESMD的發生。

1 HIF-1α的上游信號通路

MAPKs家族信號通路 MAPKs是廣泛存在于真核生物體內的可以調控細胞缺氧、凋亡及增生等反應的一種激酶信號系統[15]。目前研究發現MAPKs家族信號通路至少包含3條信號通路，即p42/p44/MAPK、JNK/MAPK、p38/MAPK信號通路。MAPKs家族信號通路通過逐級磷酸化使細胞內信號不斷放大而傳導至下游的HIF-1α，從而達到調控下游HIF-1α的轉錄激活過程的目的。

p42/p44 MAPK作為雙絲/蘇氨酸蛋白激酶，對多種轉錄因子的磷酸化的起到高度調節作用。絲/蘇氨酸蛋白激酶對HIF-1α的磷酸化具有重要的作用，由于p42P/44 MAPK是雙絲/蘇氨酸激酶，因此能夠調節作為缺氧誘導轉錄激活的HIF-1α的活性，缺氧所導致的細胞膜內外電泳的平衡失調而引發p42/p44/MAPK信號通路激活對下游轉錄因子HIF-1α的激活起到重要作用。P42/p44MAPK通路對于HIF-1α激活的主要機制可能是直接磷酸化HIF-1a或上調其輔助因子p300來誘導HIF-1α的反式激活功能。HIF-1α的本質是一種高度磷酸化的蛋白，且HIF-1a會引起明顯的電泳遷移。亦有動物實驗證實P42/P44 MAPK能夠使HIF-1a磷酸化，且能有效地啟動HIF-1α的轉錄活性，但和HIF-1α的穩定性無關[16]。綜上所述，缺氧可以導致 p42/p44 MAPK的活化，入核后促使缺HIF-1α的磷酸化，激活轉錄VEGF等與血管新生相關的下游因子，作用于內皮細胞，從而導致視網膜及脈絡膜新生血管的形成。這一結果對于理解和未來防治眼內新生血管相關疾病具有一定的價值。

JNK最初被命名為應激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK），是在小鼠肝臟中被發現的一種激，隨著它對c-Jun轉錄因子起到磷酸化并能夠使后者被激活的功能被發現，故更名為JNK[17]。JNK被一系列的磷酸化事件激活后在體內通過相關蛋白及因子的轉錄、修飾后參與由缺氧引起的由HIF-1α參與的相關基因轉錄。P38 MAPK是MAPK家族的另一種類型的SAPK，多種細胞外刺激均通過促進 P38 TGY主干磷酸化而觸發P38信號途徑，這些刺激多數與細胞應激反應有關[18]。P38激活在HIF-1α轉錄、血管生成及蛋白合成過程中起到重要作用。p38對HIF-1α調節作用主要體現在其能使HIF-1α實現磷酸化且能抑制HIF-1α的羧基抑制區的抑制作用。此外，JNK及p38對VEGF的基因穩定表達亦有重要作用，這主要通過阻斷VEGF基因的降解來達到[19]。

Pl3K/Akt/mTOR信號通路在多種細胞中均有表達，參與調節細胞的新陳代謝、增殖、凋亡等生理過程。Pl3K是一種由催化亞基和調節亞基構成的異二聚體，可被多種生長因子和信號傳導復合物激活。磷脂 酰 肌 醇3，4，5-三 磷 酸（phosphatidylinositol 3，4，5-P3，PIP3）是PI3K產生的重要脂質第二信使，在多條信號轉導途徑中起著至關重要的作用。Akt是Pl3K主要的下游信號分子，其氨基端的PH結構域能夠識別PIP3并產生相互作用，引起Akt催化結構域及調節結構中的308位蘇氨酸（Thr308）和473位的絲氨酸（Ser473）兩個識別位點發生磷酸化，從而使Akt活化從胞漿移位到胞膜上并啟動下游的信號分子，其中就包括激活mTOR，mTOR活化后可繼續向下游傳導信號，最終產生調節蛋白質合成、血管新生和細胞周期等生物學過程的效應[20]。有研究發現，PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活可通過HIF-1α依賴性和獨立機制增加VEGF的分泌[21]。一方面，mTOR的主要復合體形式mTORC1能夠通過直接增強VEGF及其下游相關因子的產生促進血管新生過程；另一方面，PI3K/AKT/mTOR信號通路還能增強HIF-1α的表達，而HIF-1α表達的增加則會進一步促進VEGF的表達，加速新生血管的形成。

2 HIF-1α調節的下游因子

視網膜的生理結構包括具有高代謝、高需氧特點的視網膜視錐細胞及視桿細胞，此外，色素上皮的氧氣供應依賴脈絡膜毛細血管層[22]。由此可見，缺氧、缺血對視功能的影響是顯著的。視網膜新生血管及脈絡膜新生血管盡管形成部位及病理機制不盡相同，但均是由于局部的缺血、缺氧導致。且眾多學者認為，在ESMD的脈絡膜新生血管形成過程中，缺氧狀態下HIF-1α穩定表達所誘導的下游新生血管相關因子的表達起到重要作用[23]。

HIF-1α對VEGF的調控作用 CNV不同于眼底的正常血管，它由于血管壁發育不完善而容易導致眼底反復的出血、滲出直至產生瘢痕化組織，且這種病理形態波及黃斑區可引起中心視力的下降[24]。而在血管新生的生長過程中位于視網膜色素上皮巨噬細胞中的VEGF能通過激活內皮細胞的遷徙及有絲分裂以誘導新生血管形成。HIF-1α的調控下可以使VEGF過度表達，其發生機制在于缺氧狀態下使得HIF-1α無法被ODD區的泛素化途徑降解而得到穩定的表達，由此可以進入細胞核內并與VEGF結合促進其表達。因此，受HIF-1α轉錄調控的VEGF在脈絡膜新生血管的產生、形成及ESMD的發病中起到的重要作用得到充分佐證。HIF-1α對EPO、Ang、PLGF、SDF-1的調控作用 除此之外，多種細胞因子的上調均與HIF-1α的轉錄作用有關，如：EPO、Ang、PLGF、SDF-1等。HIF-1α對新生血管的形成的調節，并不僅僅只是簡單的促進介導血管新生的和核心因子VEGF的表達上調，而是通過在缺氧時實現HIF-1α對下游眾多新生血管相關的細胞因子的調控方可充分發揮促血管生成的作用。

EPO是一種激素類糖蛋白，可以激活紅細胞的生成，它是迄今為止被發現的第一個HIF-1α靶基 因[25]。關于EPO的研究，人們的對它的認識水平由最初的認為EPO僅是促進紅系祖細胞成熟和增值的關鍵，而后進一步研究發現EPO可以通過促進血紅蛋白合成而成為人體在經受缺氧時的重要代償機制。在缺氧的條件下為提高機體運輸氧氣的能力，需要通過提高EPO的表達水平來促進紅細胞的生成以達到糾正機體內缺氧情況。王濟民[26]等通過觀察堿燒傷造膜CNV大鼠的動物實驗觀察到隨著缺氧程度增強，HIF-1α的表達亦增強，而EPO作為受到HIF-1α調控的下游靶基因之一，表達也隨之上調，從而達到促進新生血管生成的目的。

Ang家族是由Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4組成的一族分泌型生長因子，由視網膜色素上皮細胞分泌。其中，Ang家族中Ang-1和Ang-2是與血管生成關系最密切的成員，因二者之間存在相互拮抗作用并共用同一個受體Tie-2，故二者存在競爭作用。據前人研究顯示，Ang-1對新生血管的作用不體現在對內皮細胞的增殖作用，而是通過抑制內皮細胞的凋亡進而參與內皮細胞的遷移及促進新生血管的成 熟[27]。Ang-2則在血管形成早期與VEGF協同參與血管發芽及轉化。另有基礎研究證實受體Tie-2以及Ang-1和Ang-2存在于脈絡膜新生血管組織中，此外，Ang-1和Ang-2的表達和分泌直接或間接的受HIF-1α的調控[28-29]。在HIF-1α的調控作用下Ang-2可以通過打破Ang-1誘導的血管穩定狀態，從而使血管外周細胞與內皮細胞分離，從而更好的接受其他促血管生成因子的作用，在Ang家族與其他促血管生成因子的協調作用下，促發新生血管的形成與發展，這與CNV的形成亦密切相關。

PLGF是一種分泌型二聚體糖蛋白，于1991年從人體胎盤cDN文庫分離純化而來[30]。作為VEGF家族中的一員，PLGF的蛋白氨基酸排序與VEGF的同源性高達42%，其促進新生血管生成的作用亦不容忽視。缺氧條件下，HIF-1α對調節全是的穩定狀態起著主導作用，可通過調控下游PLGF來刺激血管內皮細胞的增生及遷移，并能加強VEGF-A藥物對新生血管的抑制作用的活性，與眼部的病理性新生血管密切相關。Ioanna Z等[31]通過使用酶聯免疫吸附試驗對ESMD患者及其他缺氧相關視網膜病變患者的血漿中PLGF濃度進行測定發現ESMD患者的血漿PLGF水平顯著升高，這也證實了缺氧誘導發生的ESMD與PLGF的表達水平的相關性。

SDF-1是一種氨基酸多肽趨化因子，它由SDF-1α及SDF-1β兩個亞基構成[32]。SDF-1的特異性受體為CXCR4，CXCR4受體可使SDF-1通過與相應的干細胞黏附或遷移至局部缺氧組織，介導新生血管生成以促進缺氧組織的修復。在缺氧環境中，造血干細胞可以分化為血管內皮祖細胞，然后依賴HIF-1α調控SDF-1等趨化因子使血管內皮細胞完成遷移，參與缺氧組織中新生血管形成。前人研究中的動物實驗及細胞實驗中觀察到HIF-1α表達水平迅速升高，隨后SDF-1在人視網膜色素上皮細胞中的表達水平亦升高，證實了缺氧特異性HIF-1α對人視網膜RPE細胞上SDF-1的表達存在調節作用[33-34]。因此，通過對SDF-1上游轉錄活性因子HIF-1α的抑制或對于兩者的共同干預將對整個視網膜新生血管疾病的發展和并發癥治療具有廣泛應用前景。

通過抑制HIF-1α表達治療ESMD的研究

目前對于ESMD 的治療中，抗VEGF藥物已成為眼科臨床醫師公認的首選用藥，目前已應用于臨床的抗VEGF藥物包括雷珠單抗、康柏西普、阿柏西普等。但抗VEGF藥物在臨床應用過程中亦顯現出許多缺點，因此，以HIF-1α為治療靶點的研究方向亦得到眾多學者的關注。

1 中醫藥對于HIF-1α的研究進展

傳統中醫藥治療不僅價廉效彰，且能調和全身機能，在滲出性老年性黃斑變性的診療上亦有其優勢，通過個體化“辨證施治”，以“整體觀念”調整全身臟腑、氣血、陰陽，改善整體、黃斑局部的缺血、缺氧狀態，使“五臟六腑之精氣上注于目”。因此，中醫藥在滲出性老年性黃斑變性的治療中占據重要的地位，目前眼科研究學者們針對滲出性老年性黃斑變性的治療主要從肝、腎論治。李傳課教授等[35]認為，年老和肝腎不足是滲出性老年性黃斑變性的基本病理，并采用滋養肝腎治法，方用滋陰明目丸加減。曹明芳教授等[36]認為滲出性老年性黃斑變性的中醫療法應從肝、腎論治，肝腎同源、互為資本，目受精血充養故得“清、明”，方選歸芍地黃湯加減。莊蘋等[37]認為肝腎不足時本病最基本的病機，并采用四物五子湯以補益肝腎為主進行臨床觀察，證實了滲出性老年性黃斑變性患者血液流變學狀況可以通過補益肝腎而得到改善。四物五子丸全方具有補益肝腎、益精養血的作用?，F代藥理研究對四物五子丸組成藥物的研究表明，白芍[38]具有緩解痙攣及疼痛痛、抵抗驚厥、消炎、滅菌、調節免疫及血管擴張、抗血小板凝集等作用，其主要成分白芍總苷可通過抑制PI3K/HIF-1α信號通路發揮調控作用。當歸[39]揮發油能夠通過抑制PC1細胞因缺血和缺氧而誘發的自噬激活來保護受損細胞。此外，當歸的另一種活性成分阿魏酸鈉可以抑制HIF-1α的表達。熟地黃[40]具有抗衰老、通過改善血液流變學，防止各種誘導阻礙外周微循環的慢性疾病的作用。川芎[41]其有效成分川芎嗪可以通過下調HIF-1α的表達，維持促血管調節因子與抑制血管生成因子之間的動態平衡，保持血管正常化。菟絲子、覆盆子、枸杞等可以抗衰老、抗缺氧，枸杞子提取物能有效地保護視網膜。地膚子、車前子抗炎、抗氧化。因此，關于四物五子丸治療滲出性老年性黃斑變性的機制在于可改善缺血缺氧狀態、抑制氧化應激反應，抗炎，調節免疫等，抑制病理性新生血管生長，提高視力。若能使中藥與現代醫療手段相結合，就HIF-1α在ESMD疾病發展中扮演的重要角色著手，或許能在ESMD的防治方面啟迪新的思路。

2 抗HIF-1α藥物的研究進展

抗HIF-1α藥物的種類繁多，且其對CNV的抑制作用已得到證實。抗血小板凝集劑YC-1能抵抗細胞中HIF-1α與DNA的結合，此外，還可降低鈷的表達來減少HIF-1α蛋白的累積[42]。從而下調HIF-1α所調控的下游因子EPO及VEGF的表達水平，以達到抑制CNV發生的作用。地高辛作為強心苷類藥物，其對與新生血管的抑制作用來源于它對腫瘤的應用，而后有研究表明地高辛能抑制HIF-1α及VEGF的表達[43]。針對HIF-1α基因的抑制藥物對治療CNV亦顯示出重要作用，如小干擾RNA則在小鼠動物實驗中被證實可以減少HIF-1α及VEGF mRNA和蛋白的表達[44]。此外，抗HIF-1α藥物在臨床的應用廣泛，包括在腫瘤、白血病及其他缺氧誘導的疾病中均能發揮作用。

小 結

目前針對ESMD的治療，中醫藥雖然有效但存在療程較長，且對于促進新生血管消退效果不佳[45]；現代醫學用藥中以抗VEGF藥物為主流，對促進已有的新生血管消退有一定療效，但存在著需要反復注射藥物且不能抑制新的CNV生成[46]，因此，僅僅使用抗VEGF藥物不足以解決所有問題。此外，使用VEGF抑制劑不僅會作用于結構脆弱且不健康的新生血管的VEGF，正常血管的VEGF也會受到影響。加之HIF-1α在ESMD發生、發展過程占據了關鍵地位，所以對于HIF-1α在ESMD治療中的研究顯得尤為重要。抑制HIF-1α不僅能阻斷對血管生成占最主要地位的生長因子VEGF的傳導，還能阻斷HIF-1α下游所調控的EPO、Ang、PLGF、SDF-1等與血管新生密切血管的生長因子。目前，對于HIF-1α抑制劑在缺氧導致的視網膜脈絡膜新生血管的應用已有研究成果，為ESMD的治療提供了新的靶點。抗血小板凝集劑YC-1、地高辛、魚藤素等作為HIF-1α抑制劑在激光誘導CNV的動物實驗中顯示出了對于HIF-1α蛋白活性及對包括VEGF在內的受HIF-1α調控的生長因子的抑制作用[47]。不同于抗VEGF藥物的是HIF-1α抑制劑不僅可以抑制已有的新生血管的進展，還可以減少未發生的新生血管生成，此外，它對于視網膜的正常發育及其他正常微小結構并無破壞作用。故我們可以認為HIF-1α抑制劑對于ESMD的治療存在很大的潛力，是值得深入探索的治療靶點。