基于肽組學的大豆低聚肽制備穩定性評價

郁曉藝 徐巨才 伍 鎣 劉萬順 郭 丹 李曉敏

(1.完美〔廣東〕日用品有限公司，廣東 中山 528400；2.五邑大學生物科技與大健康學院，廣東 江門 529020；3.江門市大健康國際創新研究院，廣東 江門 529020)

大豆低聚肽主要指大豆蛋白經深度生物酶解技術處理后所形成的酶解產物，因具有綠色、安全、無毒副作用等多種優良特點，備受廣大消費者和科研學者青睞[1]。大豆低聚肽的分子量大多在1 000 Da以下，在人體消化系統中具有較好的消化吸收特性，且基本保留了大豆蛋白原有的優質氨基酸組成，同時還具備了遠優于大豆蛋白的溶解性和生理活性[2]。近年來，研究發現大豆低聚肽具有抗氧化[3]、降血壓[4]、抗疲勞[5]等多種生理活性，極大地促進了大豆低聚肽產業的快速發展。與此同時，大豆低聚肽的應用也在一定程度上改善了國內大豆粕或大豆蛋白資源的利用情況，為充分挖掘低值蛋白資源的營養價值、功能價值和經濟價值提供了重要途徑[6]。

近年來，國內外相關研究大多聚焦于目標多肽的構效關系和活性作用機理[7-9]，而較少關注制備過程中多肽的組成及變化情況。大豆低聚肽作為較早實現工業化的植源性低聚肽之一，至今仍主要依賴于水解度、氨基酸、肽分子量分布等間接或宏觀技術指標進行質量控制或評價[10-12]，而關于其多肽的組成情況一直尚未見相關報道。由于缺失酶解產物中多肽的分子組成信息，上述技術指標在進行原料質控時，常呈現為特異性不足，為多肽原料供應的穩定性評價和品質鑒別帶來一定困擾[13]。尤其隨著近年來多肽制備技術的不斷推廣和逐漸普及，市場開始出現魚龍混雜、品質良莠不齊等現象。為保障和促進多肽產業的規范、良性發展，對多肽原料開展更精準的穩定性評價和品質鑒別研究已迫在眉睫。

研究擬以相同工藝不同生產批次的大豆低聚肽為研究對象，利用質譜多肽組學分析技術解析原料的多肽組成，再結合集合分析、主成分分析等探討批次間原料的共性與差異性，以期為多肽原料的制備穩定性評價提供新思路，并為相關原料的精準質控提供理論指導和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆低聚肽(A、B、C、D、E共5批次樣品)：完美(廣東)日用品有限公司；

乙腈、甲酸：質譜純，美國Sigma公司；

超純水：實驗室自制；

色譜柱：1 × 100 mm HSS T3(1.8 μm，1 mm)，美國Waters公司。

1.2 主要儀器設備

十萬位分析電子天平：Secura125-1CN型，德國賽多利斯公司；

高分辨液相色譜—飛行時間質譜聯用儀：X500 LC-ESI-Q-TOF型，美國AB SCIEX公司；

純水機：Milli-Q型；德國Millipore公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備 以大豆低聚肽為樣品，用超純水配置成2 mg/mL溶液，充分溶解后過0.22 μm濾膜上機分析。

1.3.2 高分辨液質聯用檢測分析 參照Lenco等[14]的方法修改如下：流動相由體積比1∶999的甲酸水溶液(A)和乙腈(B)組成，洗脫方法為：0.00～4.00 min 5.0% B，4.00～6.00 min 5.0%～10.0% B，6.00～30.00 min 10.0%～40.0% B，30.00～34.00 min 40.0%～90.0% B，34.00～40.00 min 90% B，40.00～42.00 min 90.0%～5.0% B，42.00～52.00 min，5.0% B，流速0.05 mL/min，進樣量1 μL，柱溫40 ℃；質譜檢測方法：掃描周期0.642 s，ESI離子源溫度500 ℃，正離子模式，噴霧電壓5 500 V，TOF一級掃描范圍100～1 200 Da，二級掃描范圍50～1 200 Da，工作模式IDA，最大候選離子數4，開啟動態排除，其余參數使用蛋白質組學方法默認值。

1.3.3 多肽組學鑒定與分析 使用ProteoWizard 3.0(美國ProteoWizard公司)對質譜數據(wiff2)進行格式轉換(Mgf)，再分別采用Proteome Discoverer 2.4(美國Thermo公司)進行長肽鑒定處理和PepOS多肽組學分析軟件1.0(廣東省五邑大學)進行短肽鑒定處理。其中Proteome Discoverer 2.4的參數設置為多肽長度6～25，一級母離子誤差0.02 Da，二級子離子誤差0.02 Da，解譜引擎為Sequest，蛋白序列庫為從UniProt下載得到(https://www.uniprot.org/，檢索關鍵詞“soybean”，下載日期2021年12月1日)，鑒定離子簇類型為a、b和y離子簇，錯誤發現率1%，其他參數使用默認設置；PepOS參數設置為多肽長度2～5，一級母離子誤差0.02 Da，二級子離子誤差0.02 Da，解譜引擎為Exaust，鑒定離子簇類型為a、b和y離子簇，評分閾值為100分(須至少匹配一種混和離子簇)，并行CPU核心數12。不同批次間樣品多肽序列交、并集運算采用Python 3.8、Matlab2015A進行。多肽離子批量抽提采用SCIEX OS 2.0(美國AB SCIEX)，高豐度多肽手動序列或結構確認采用Biotools 3.2(德國Bruker公司)。

1.3.4 主成分分析 基于樣品在質譜中所檢測到的一級母離子，使用MarkerView 1.3(美國AB SCIEX)對不同樣品進行PCA主成分分析(Principal Component Analysis)，保留時間差異閾值設置0.50 min，質荷比差異閾值0.01 Da，最大獲取峰數量3 000，豐度閾值設置為2 000，主成分分析因子權重方法為Logarithm，評分方法為Range Scale。

1.3.5 數據輔助處理與可視化 采用Excel 2013、Origin 2018、Python 3.8、Matlab 2015a等軟件進行數據輔助處理與可視化。

2 結果與討論

2.1 不同批次低聚肽的液質聯用分離

由圖1可知，相同工藝不同批次的大豆低聚肽熱度宏觀分布基本一致，但存在細小差異，可能是由于色譜峰的漂移或自身組成差異所致。樣品在T3色譜柱中的分離區間主要集中于1～25 min，而在25 min后的高有機相洗脫區域僅極少組分流出，這主要與食源性低聚肽中極性肽段較多有關。食源性低聚肽在制備過程中，所用酶制劑常為粗酶，且作用位點大多廣泛，故酶解產物中多肽的特異性較差，且產物中易存在大量的極性多肽[10,15]。這些多肽在反相色譜分離過程中，常在洗脫初期出現一簇或多簇強響應洗脫峰。T3色譜柱在常規C18色譜柱的基礎上，采用鍵合技術敲除柱填料表面的部分烷基疏水鏈，因而較常規C18色譜柱更適于食源性低聚肽的液質分離[16]。此外，試驗中，所用T3色譜柱為窄內徑色譜柱(內徑僅為1 mm)，對于提升多肽離子在微升級質譜離子源中的靈敏度亦具有重要作用[14]。

圖1 不同批次大豆低聚肽的熱度圖

2.2 多肽組學分析效果評價

對上述質譜數據進行多肽組學分析鑒定，統計各批次樣品的譜圖和多肽鑒定情況如圖2所示。其中，譜圖鑒定量(Peptide Spectra Matches，PSMs)描述了不同批次樣品在分析過程中所采集到的多肽二級譜圖鑒定量，包含重復鑒定為同一肽段的二級譜圖[17]；多肽鑒定量描述了不同批次樣品經分析鑒定得到的非重復性多肽數量；由圖2可知，不同批次樣品的組學分析效果相近，平均每個樣品有約2 000張譜圖(PSMs)得到鑒定，平均非重復性多肽鑒定數量接近1 000，平均每條肽段的鑒定支持譜圖數量約為2，說明鑒定結果具有良好的譜圖數據支撐，可靠性較高；不同批次樣品的制備具有較好的宏觀穩定性。

圖2 多肽鑒定效果評價

值得注意的是，上述已鑒定多肽大部分為短肽(長度2～5)，僅有極少部分多肽為長肽。推測這主要與食源性蛋白質在酶解過程中常采用廣譜性粗酶有關。廣譜性粗酶純度較低，同時作用位點較為廣泛，因而其作用蛋白質后所得產物常呈現為大量的短肽[18]。為進一步對上述現象進行驗證，對樣品A的多肽組學數據進行進一步統計分析，結果如圖3所示。由圖3可知，低聚肽樣品A的肽段分布以2～5為主，尤以3～5居多；低聚肽樣品A中大部分多肽長度為2～5，尤以2～4的離子峰面積占比較高。這充分驗證了上述理論推測，同時，大量短肽的存在亦較好地解釋了大豆蛋白經生物酶處理后其溶解性、鮮味特性、消化特性等得以顯著提升的原因。

圖3 大豆低聚肽樣品的多肽長度分布特性

2.3 不同批次間樣品的多肽集合分析

由圖4可知，不同批次樣品間存在共性多肽101條，其中長肽10條，短肽91條。與此同時，每個批次樣品中均有部分肽段無法在其他批次中被檢測到，可能與食源性蛋白質酶解過程的重現性和隨機性有關，蛋白酶分子與蛋白底物的相遇和結合在物料反應體系中具有一定的隨機性，酶催化位點的斷裂亦存在一定的概率隨機性，因此其終產物多肽組成分布可能存在一定差異[19]；也可能與質譜檢測過程中色譜峰的漂移和離子抑制等有關，當色譜峰存在漂移時，其引發的不同程度的離子抑制可導致多肽質譜檢測譜圖出現差異，進而導致鑒定結果出現差異[20]。此外，在質譜母離子轟擊過程中，亦可能因雜離子的干擾導致檢測結果出現差異[21]。目前，消除這些檢測差異仍有待質譜技術和多肽組學分析方法的進一步發展。但可以肯定的是，不同批次樣品間多肽的組成共性與差異并存。絕對的重現性制備在實際生產中是不存在的，生產過程中任何一種因素的變化都可能導致產物的多肽組成差異。未來，不斷提升設備自動化程度和重現性操控能力，將是不斷縮小差異提升共性，實現“求同存異”的關鍵。值得注意的是，樣品E的獨有多肽數量(198)明顯高于其他批次樣品，在一定程度上反映樣品E與其他批次樣品之間可能存在較大差異。

圖4 不同批次間樣品的多肽集合分析

2.4 不同批次低聚肽的PCA主成分分析

對不同批次大豆低聚肽樣品進行PCA主成分分析，通過對多維質譜數據的降維處理[22-23]，將數據維度和信息簡化，并通過得分圖中樣品間的距離顯示樣品間差異。圖5中，樣品A～D均集中于得分圖下半部分，基本形成同類聚集，而樣品E與其他樣品相距較遠，在PC2軸上顯示較大差異，這一現象與圖4中樣品E獨有多肽數量差異較大的結果相一致。二者均提示樣品E有別于其他批次樣品，反映大豆低聚肽的工業生產穩定性仍有待進一步增強。

圖5 不同批次低聚肽的PCA主成分分析

2.5 高豐度多肽分析

基于圖4中所述5個批次樣品101條共性多肽進行離子抽提和峰面積積分，結合非標定量法對上述多肽的平均相對組成進行簡要分析，并對豐度前10多肽進行手動序列結構確認，結果見表1。由表1可知，豐度前10的多肽大多鏈長較短，長度以2～4居多，但值得注意的是，長肽(SEGGLIE)在相對組成中亦占據了不小的比值。說明大豆蛋白經過深度酶促水解處理后，雖然產生了大量的短肽，但與此同時，仍有部分長肽得以保留。這些長肽的保留現象可能與酶制劑的作用特性有關，盡管食品用酶制劑大多為廣譜性粗酶，但酶解過程中酶切位點的識別和斷裂可能依舊與酶制劑的種類具有一定關聯性，不同的酶制劑可能表現出不同的酶切傾向[6]。研究和掌握這些酶的作用傾向及規律，可為未來活性肽的靶向制備提供關鍵信息指引。

表1 豐度前10共性多肽

3 結論

采用肽組學分析技術，對不同批次大豆低聚肽樣品中多肽的組成共性與差異展開探討，評價了大豆低聚肽的工業制備穩定性。不同批次樣品的質譜總離子流曲線基本一致，且多肽組學分析效果相近，每種樣品的多肽鑒定量均為1 000左右，組成均以短肽居多，反映不同批次大豆低聚肽之間具有較好的宏觀一致性。然而，進一步的多肽集合分析和PCA分析均提示第5批次樣品與其他樣品間多肽組成差異較大，反映目前大豆低聚肽的工業生產穩定性仍有待進一步加強。相同工藝條件下，不同批次間原料的多肽組成整體表現為共性與差異并存，但在實際生產過程中，應加強質控以逐步縮小差異增強共性，進而提升工業制備的穩定性。未來，在宏觀質控的基礎上，利用高豐度共性多肽對原料進行精準微觀質控，將是多肽質量研究的重要發展方向之一。