一種用于核酸即時檢測的全集成微流控芯片*

楊馥瑞，吳夢希，劉軍山

（大連理工大學遼寧省微納米技術及系統重點實驗室，遼寧大連 116024）

0 引言

病原體嚴重威脅人類生命健康和社會經濟發展[1]。病原體的檢測方法包括核酸檢測、抗原抗體檢測、分離培養等。其中，核酸檢測具有高靈敏度和高特異性等優點，已成為病原體檢測的金標準?；诔Ｒ幘酆厦告準椒磻≒CR）的核酸檢測需要在3 個不同溫度之間進行幾十次的擴增循環，操作復雜、耗時長。因此，研究人員開發了多種基于等溫擴增的核酸檢測技術，例如環介導等溫擴增（LAMP）[2-3]，在恒定溫度下較短時間內便可以完成核酸檢測過程。

現場即時檢測（Point-of-care Testing, POCT）與傳統的病原學檢測方法相比，具有操作簡單、快速等特點[4]，在疫情防控等領域極具應用潛力。微流控芯片具有微型化、集成化和便攜化等特點，特別適合用于核酸的即時檢測。然而，目前大多數基于微流控芯片的核酸檢測系統需要復雜昂貴的檢測設備和液體驅動設備等[5-7]。例如，2010 年，德國弗賴堡大學的Lutz 等[8]研制的微流控檢測系統需要離心設備進行芯片上的液體驅動。2021 年，北京航空航天大學研制了一種全集成微流控芯片，利用指壓便可以實現芯片上的液體驅動，借助紫外燈可以用肉眼讀出檢測結果，實現了結核桿菌的現場即時檢測[9]。但是，為了實現多靶標檢測，該芯片需要利用復雜的閥結構實現擴增反應池間的物理隔離。2009年，美國芝加哥大學的Du等[10]提出了一種滑動式結構的微流控芯片，在芯片的基片上制作出微溝道，在芯片的滑動片上制作出液體腔室，利用兩片之間的相對滑動，便可以實現不同液體腔室間的連通或者隔離。之后，又有多位學者對滑動式結構的微流控芯片進行了相關研究。例如，2011 年，美國芝加哥大學的Shen 等[11]研制了一種只有硬幣大小的旋轉式滑動芯片，可以連續生成納升級液滴，用于定量檢測HIV和HCV病毒。

為此，本文針對核酸現場即時檢測的需求設計了一種基于LAMP 技術的全集成微流控芯片，能夠完成核酸的提取和擴增功能，利用一次性注射器進行芯片上的液體驅動，借助紫外線驗鈔筆便可用肉眼直接讀出核酸檢測結果。而且，在芯片的擴增區域采用了滑動式芯片結構，實現了16個擴增反應池之間的物理隔離，因此該芯片可用于多靶標檢測。

1 芯片的設計

圖1（a）為本文設計的全集成微流控芯片的結構示意圖，在芯片的基片上制作了微通道和試劑池等結構。根據功能，將芯片分為3 個區域：核酸提取區、混合區和擴增區，如圖1（b）所示。

圖1 全集成微流控芯片

（1）核酸提取區。為了實現便攜化操作，選擇了磁珠法進行核酸的提取，為此該區域設計了4 個試劑池：磁珠池、裂解池、清洗池1和清洗池2。磁珠法的基本原理為：磁性納米顆粒可以與核酸分子特異性結合，利用磁場操控磁性顆粒運動，便可以在不同區域分別實現裂解、清洗等核酸提取步驟。

（2）混合區。該區域設計了1個洗脫池、1個擴增試劑池和1 個方波混合器，主要用于實現核酸的洗脫以及與擴增試劑的充分混合。為了便于操作和縮短檢測時間，選擇了LAMP 擴增法，因此在擴增試劑池里存放LAMP Mix試劑。

（3）擴增區。為了實現多靶標核酸檢測，在該區域采用了滑動式芯片結構。在基片上設計了用于液體流動的微溝道，在滑動蓋片上設計了16 個擴增反應池，利用低熔點石蠟（48～50 ℃）將擴增引物預先包埋在各個反應池內。當需要將待測溶液引入擴增反應池時，移動蓋片使反應池與微溝道連通，此時由于引物被石蠟包埋在反應池底部，因此不會發生反應池間引物相互混合的現象。當需要進行擴增反應時，移動蓋片使反應池與微溝道斷開，從而實現各反應池之間的徹底物理隔離。

圖1（c）所示為采用精密銑削制作出的聚碳酸酯（PC）微流控芯片，圖1（d）所示為則為注入各種試劑后的芯片照片。

2 芯片的操作步驟

芯片的操作步驟包括實驗前的芯片預備步驟和核酸檢測步驟。其中，預備步驟主要包括：（1）利用移液槍將不同類型的擴增引物加入擴增反應池中，然后將低熔點石蠟融化后依次加入各反應池，待石蠟由液態轉為固態時，引物便被包埋在反應池底部；（2）將磁珠、裂解液、清洗液1、清洗液2、洗脫液和LAMP Mix 試劑加入各儲液池中，然后利用膠帶將注液孔密封；（3）在滑動蓋片與基片之間涂覆少許無菌液體石蠟，保證兩片緊密貼合。

核酸檢測步驟主要包括：（1）將20 μL 樣品注入裂解池，在室溫下保持5 min，完成裂解過程；（2）利用一根釹鐵硼永磁棒移動磁珠，使其依次通過清洗池1、清洗池2 和洗脫池，磁珠在兩個清洗池處各停留1 min，洗去殘留的蛋白質等雜質，在洗脫池中停留3 min，使核酸脫落磁珠表面，然后將磁珠移回清洗池2 中；（3）利用一次性注射器，手動向芯片內緩慢加壓，使核酸洗脫液與LAMPMix 試劑同時進入方波混合器，得到混合均勻的待測溶液；（4）再次加壓，將待測溶液注入16個擴增反應池中，將滑動蓋片向上推移，反應池間實現物理隔離；（5）將芯片升溫至65 ℃，保持40 min，完成核酸擴增；（6）利用波長為365 nm 的紫外線驗鈔筆依次照射各反應池，發生了擴增反應的樣品池在照射下會發出明亮的綠色熒光，而未發生擴增反應的樣品池則暗淡無光。

3 結果與討論

3.1 方波混合器

方波混合器是微流控領域中常用的一種二維混合器，主要利用尖角處的湍流和層流間的液體擴散來完成溶液混合[12]。根據Chen 等[13]的研究，在相同直徑、流速以及縱向長度的情況下，方波形的混合器比其他類型的混合器效率更高。為此，結合全集成微流控芯片的外觀尺寸，對方波混合器的長度和直徑進行了設計。

利用COMSOL 軟件對方波混合器的進樣和混合效果進行了模擬仿真。在模擬氣壓推動液體進樣時，利用了物理場中的兩相流-水平集-層流。如圖2（a）所示，仿真結果表明，在氣體壓強和受壓面積相當的條件下，洗脫池與擴增試劑池中的液體（紅色）可在空氣（藍色）的擠壓下同時完成進樣。圖2（b）為對應的實驗結果，可見仿真與實驗結果基本一致。

圖2 方波混合器進樣效果圖

在模擬混合效果時，采用了物理場中的單相流-層流，建立的仿真模型如圖3（a）所示，進樣速度設置為50 mm/s。利用參數掃描，研究了擴散系數對于出口濃度的影響（圖3（b）），以及入口濃度對于混合效率的影響（圖3（c））。水溶液常溫條件下擴散系數為10-10～10-9m2/s 之 間，這 里 將 擴 散 系 數 設 置 為：1×10-11～1×10-9m2/s，而入口濃度設置為：1～50 mol/m3?？梢钥闯鰯U散系數和入口濃度均不會影響液體的方波混合器的混合結果。同樣，利用藍紅兩種液體，對方波混合器的混合效果進行了實驗驗證。如圖3（d）所示，兩種顏色的液體經過方波混合器后得到了充分混合，形成了均勻的紫色。

圖3 方波混合器混合效果圖

3.2 滑動式擴增反應池

利用熒光素鈉溶液對滑動式擴增反應池的物理隔離效果進行了實驗驗證。首先，在相互間隔的8 個反應池中加入相同濃度的熒光素鈉溶液，待其風干后用石蠟對其進行包裹。其次，移動蓋片使反應池與微溝道連通，向反應池中注入去離子水。接著，將滑動蓋片向上推移，使16 個反應池實現物理隔離。然后，將芯片放置到加熱板上進行加熱，在65 ℃保持40 min。最后，利用紫外線驗鈔筆對芯片進行照射。如圖4（a）所示，8 個加入了熒光素鈉的反應池發出了綠色熒光，而其他8 個反應池則沒有熒光產生，表明本文設計的滑動式結構可以在沒有任何閥結構的情況下實現反應池間的物理隔離。

圖4 擴增反應池的隔離效果驗證

此外，還利用熒光顯微鏡對芯片進行了拍攝（熒光波長為350～500 nm），采用ImageJ圖像軟件對8個加入熒光素鈉反應池的熒光面積和熒光強度進行了計算。如圖4（b）所示，8 個反應池的熒光面積基本一致，表明初始加入的石蠟量不會影響陽性結果的判定。8 個反應池的均一化熒光強度基本相等，證明注入的去離子水能夠與各擴增池中的熒光素鈉完全混合，進一步證明了該滑動式擴增反應池可以滿足多靶標核酸檢測的要求。

4 結束語

本文設計了一種基于LAMP 技術的微流控芯片，只需要一個一次性注射器和一支紫外線驗鈔筆，便能夠實現核酸的提取、擴增和檢測功能，未來有望用于病原體的核酸即時檢測。將芯片分成了3 個功能區：核酸提取區、混合區和核酸擴增區，對各功能區內的儲液池和微溝道等進行了設計，探討了核酸的提取和擴增方案，分析了芯片的工作流程。利用COMSOL 軟件對芯片上的方波混合器進行了模擬仿真，并進行了實驗測試，檢驗了混合器的液體混合能力。利用熒光素鈉溶液，對芯片上的滑動式擴增反應池的物理隔離性能進行了測試，實驗結果表明該結構能夠在核酸擴增反應過程中實現反應池間的物理隔離，滿足了芯片多靶標核酸檢測的要求。