黃連素治療慢性心力衰竭的網絡藥理學分析

張澤宇，閆海峰，閆 利

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是一種以心室結構改變、射血功能異常為特征的慢性進行性心血管系統疾病，以乏力、胸悶氣短、水腫、血瘀等臨床表現為主，最終導致死亡[1]。黃連素又稱為小檗堿，是一種異喹啉衍生生物堿，存在于黃連、小檗、黃芩、黃柏等多種具有藥用價值的植物根莖、樹皮和果實中，在我國中醫學和阿育吠陀醫學中已有兩千多年的藥用歷史，有研究證實，黃連素具有降低血糖、調節血脂、抗心律失常、抗氧化及正性肌力等生物活性，對心臟具有保護作用[2]。以0.2 mg/(kg·min)的劑量靜脈輸注黃連素可降低右心房和左心室舒張末期壓力，增加左室射血分數，降低動靜脈氧差[3]。已有研究證實口服黃連素可改善CHF病人生活質量，并降低室性期前收縮和死亡發生率[4]。基礎研究、轉化研究和臨床研究表明，黃連素通過調節哺乳動物雷帕霉素靶蛋白、p21 蛋白激活激酶1、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase，MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、核因子κB、腺苷酸活化蛋白激酶、胞外信號調節激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)、絲氨酸/蘇氨酸激酶、瞬態電位受體香草醛4、髓分化因子88、Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)4等信號通路靶點和鈣離子濃度改善心功能以預防CHF[5]，肝臟靶向納米技術可促進黃連素改善心臟代謝疾病[6]。證實了黃連素在預防和治療心血管疾病方面具有廣闊的應用前景。

由于黃連素治療CHF的具體作用機制尚未明確，需進一步研究。網絡藥理學是利用公共數據庫挖掘生物信息并進行分析，可多方面預測中藥成分對疾病的作用機制，同時構建可視化網絡模型，使結果清晰，在藥物研究中已廣泛應用。分子對接技術通過計算藥物成分與靶蛋白之間的親和力數值，預測其結合形式與結合能力。鑒于黃連素在保護血管內皮、縮小心肌梗死面積和改善心功能方面的作用，本研究采用網絡藥理學方法探討黃連素治療CHF的核心靶點，旨在為今后的實驗及臨床研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 CHF核心蛋白的獲取 以“chronic heart failure”為檢索詞、相關性評分>15為條件，在GeneCards數據庫(http://www.genecards.org/)中獲取CHF相關蛋白，再利用STRING數據庫(http://string-db.org)以中等置信度=0.9為條件預測蛋白相互作用關系。采用Cytoscape v3.9.0軟件，度值、介度、緊密度、網絡中心性和局部邊緣通性均大于中位值的條件下篩選2次，獲取CHF核心蛋白。

1.2 “黃連素靶蛋白”與“CHF核心蛋白”交集靶點的獲取 基于HERB數據庫(http://herb.ac.cn/)獲取黃連素靶蛋白，并與CHF核心蛋白取交集。將黃連素和交集靶點導入Cytoscape v3.8.2可視化軟件，構建成分靶標網絡，其中節點代表化合物和靶蛋白，邊代表節點間的相互作用。

1.3 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析 將交集蛋白通過Rx64 4.0.2軟件以P<0.05為篩選條件進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析主要包括生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細胞組成(cellular component，CC)，在GO富集分析得到的3部分中，將排名居前10位的功能繪制成條形圖；將KEGG通路富集分析獲取的前30條通路繪制氣泡圖(縱坐標為通路名稱，橫坐標為基因占比，圓圈面積代表富集基因數目，顏色為富集程度，紅色越深代表富集顯著性越強)，通過查閱文獻篩選疾病相關通路并在KEGG富集結果中獲取富集蛋白，利用Cytoscape v3.9.0軟件分析通路與靶點的拓撲關系。

1.4 分子對接驗證及篩選 利用STRING數據庫和Cytoscape v3.9.0軟件篩選富集核心蛋白，與黃連素進行分子對接。采用Chem3D軟件對黃連素進行結構優化，保存為lig.mol2文件；通過PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)獲取富集核心蛋白結構，并利用PyMOLWin.exe軟件去除水分子和小分子配體，保存為rep.pdb；將rep.pdb和lig.mol2文件導入AutoDock Tools 1.5.6轉化為PDBQT格式，確定活性位點；最后，利用AutoDock Vina進行分子對接，PyMOLWin.exe可視化對接結果。

2 結 果

2.1 CHF核心蛋白 通過GeneCards、STRING數據庫和Cytoscape v3.9.0軟件，篩選獲得77個CHF核心蛋白，詳見圖1。

圖1 CHF核心蛋白的篩選

2.2 黃連素靶蛋白與CHF核心蛋白的交集靶點 以HERB數據庫中共獲得91類黃連素靶蛋白，與77個CHF核心蛋白取交集(見圖2)。利用Cytoscape v3.9.0軟件將黃連素與交集蛋白的關系進行拓撲分析及可視化(見圖3)。

圖2 黃連素與CHF的交集蛋白韋恩圖

圖3 黃連素與交集蛋白的拓撲分析

2.3 GO和KEGG富集分析 富集分析表明，GO功能富集分析得到2 070個功能項(見圖4)，其中BP為1 968個，主要包括細胞化學應激反應、DNA調控-結合轉錄因子活性、炎癥反應調節等；CC為13個，主要與囊腔、RNA聚合酶Ⅱ轉錄調節復合物、轉錄調節復合物等有關；MF為89個，主要涉及細胞因子活性、信號受體激活劑活性、受體-配體活性等。KEGG通路富集分析共獲得146條信號通路(見圖5)，有研究證實，白細胞介素(interleukin，IL)17信號通路[7]、輔助性T細胞(T helper cell，Th)17細胞分化通路[8]、晚期糖基化終末產物(advanced glycation end product，AGE)-晚期糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)信號通路[9]、TLR信號通路、脂質與動脈粥樣硬化通路[10]、Th1和Th2細胞分化信號通路[11]、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號通路[12]、MAPK信號通路[13]、缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)信號通路[14]與CHF相關。獲取上述信號通路富集蛋白(見表1)，并將信號通路與靶點關系的拓撲分析結果可視化(見圖6)。

圖4 交集蛋白的GO功能富集分析

圖5 交集蛋白的KEGG通路富集分析

圖6 通路-靶點拓撲分析

2.4 核心靶點與藥物有效成分的分子對接 構建信號通路富集蛋白互作關系網絡，圖中紅色節點代表核心蛋白，即轉錄因子p65(transcription factor p65，RELA)、c-fos原癌基因蛋白(c-fos proto-oncogene proteins，FOS)、MAPK14、TNF、IL6、JUN等，藍色節點代表相關蛋白(見圖7)。受體與配體的結合能<-29.3 kJ/mol表明兩者之間具有強烈的結合能力[15]，通過分子對接技術驗證核心蛋白與黃連素之間的對接精度。結果表明，靶蛋白與黃連素的結合能<-29.3 kJ/mol(見表2)。黃連素與核心蛋白構建分子對接模式圖說明黃連素與核心蛋白強烈結合(見圖8)。

圖7 通路富集蛋白互作關系網絡

表2 黃連素與核心蛋白的分子對接結合能 單位：kJ/mol

圖8 分子對接模式圖(A代表黃連素與RELA；B代表黃連素與JUN；C代表黃連素與FOS；D代表黃連素與MAPK14；E代表黃連素與TNF；F代表黃連素與IL6)

3 討 論

已有研究證實黃連素可改善CHF病人心功能，然而，其介導的心臟保護作用機制尚未明確。網絡藥理學是基于分子層面分析黃連素的作用機制，分子對接可計算其與核心蛋白的結合能。因此，本研究通過網絡藥理學和分子對接方法，拓展黃連素與CHF的關系，初步探討其治療CHF的相關信號通路及核心靶點。GO功能富集分析表明，黃連素治療CHF主要涉及調節細胞化學應激反應、DNA調控-結合轉錄因子活性、炎癥反應調節等功能；KEGG通路富集分析表明，黃連素可能通過調控IL17信號通路、Th17細胞分化通路、AGE-RAGE信號通路、TLR信號通路、脂質與動脈粥樣硬化信號通路、Th1和Th2細胞分化信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路、HIF-1信號通路等抑制CHF的惡化。相關研究顯示，糖尿病并發癥中AGE過剩可誘導AGE-RAGE信號通路激活，促進心肌成纖維細胞增殖和氧化應激，從而對心肌造成損傷及纖維化，嚴重損害心肌收縮和舒張功能，導致CHF[9-16]。IL17信號通路可參與免疫反應，通過激活MAPK信號通路促進心室重構，有研究顯示，CHF大鼠免疫應答平衡受損伴有IL17信號通路的活化，通過抑制IL17信號通路，可改善免疫應答不平衡，進而改善CHF大鼠心臟功能[7]。賴氨酰氧化酶是一種氧化膠原蛋白和彈性蛋白的賴氨酸殘基促進相關纖維性蛋白共價交聯的蛋白酶，Th17細胞通過激活IL17-ERK1/2-活化蛋白1信號通路促進賴氨酰氧化酶表達，而調節性T細胞可激活IL10-Janus激酶信號轉導和轉錄激活因子3抑制賴氨酰氧化酶表達，因此，抑制Th17細胞分化，調節Th17/調節性T細胞平衡可緩解異丙腎上腺素誘導的心肌纖維化、CHF和自身免疫性心肌炎[8]。TLR及下游信號通路在免疫系統中發揮重要作用，參與動脈粥樣硬化、腦卒中、心肌梗死、缺血再灌注損傷、心室重構和CHF的發生，如s-亞硝基化的肌肉LIM蛋白可刺激TLR3與肌肉LIM蛋白、受體相互作用蛋白激酶3結合，誘導NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3炎性小體活化，促進心肌肥厚；阻斷TLR2活性，從而改善阿霉素和缺血引起的心功能不全和心室重構；抑制TLR2和TLR4表達，可延緩心腎綜合征進程[17-19]。冠心病是CHF的潛在重要因素，脂質與動脈粥樣硬化信號通路的激活可誘發冠狀動脈微血管循環障礙、心肌細胞損傷和僵硬，增加射血分數保留的心力衰竭事件風險[10，20]。CHF過程中腎素-血管緊張素系統的激活可產生大量的血管緊張素Ⅱ，增加Th1細胞因子γ干擾素的產生，改變Th1/Th2平衡，促進炎癥反應，導致心肌組織纖維化和壞死[11]。TNF-α以跨膜TNF-α和可溶性TNF-α形式存在，并通過(tumor necrosis factor，TNF)受體1(TNFR1)和TNF受體2(TNFR2)傳遞信號，在炎癥過程中，心肌細胞中TNFR2的蛋白和mRNA表達水平明顯上調，跨膜TNF-α通過TNFR2激活絲氨酸/蘇氨酸激酶信號通路抑制核因子κB信號通路，發揮抗心肌肥厚和抗炎作用；可溶性TNF-α在心肌肥厚和CHF中發揮重要的致病作用，可介導心肌細胞肥大并引發促炎細胞因子IL1β和IL6的進一步表達[12，21]；MAPK信號通路主要有ERK1/2、p38MAPK和JNK 3條主干，p38MAPK與JNK信號通路主要涉及心肌細胞凋亡與分化，ERK1/2信號通路的激活可促進心肌纖維化發生[13，22-23]；HIF-1信號通路與血管內皮生長因子和促紅細胞生成素轉錄引起的內皮功能障礙、平滑肌增殖、炎癥、血管生成、動脈粥樣硬化等心血管疾病密切相關[14]。通過富集蛋白核心篩選、信號通路-靶點拓撲分析及分子對接得到黃連素通過與RELA、JUN、FOS、MAPK14、TNF、IL6等核心蛋白強烈結合，進而調控上述信號通路。

4 小 結

基于網絡藥理學分析和分子對接技術，得到黃連素可能主要通過作用于RELA、JUN、FOS、MAPK14、TNF、IL6等蛋白，調節IL17信號通路、Th17細胞分化通路、AGE-RAGE信號通路等，進而在CHF治療中發揮保護血管內皮、縮小心肌梗死面積和改善心功能等作用。黃連素具有多通路、多靶點綜合調控抑制CHF病理過程的優點，該結果與臨床實踐及療效預期一致。本研究通過網絡藥理學和分子對接技術預測黃連素治療CHF所涉及的通路、靶點和結合能力，存在一定的局限性，需結合臨床和實驗進一步驗證，以評價其安全性和有效性。