金櫻子總黃酮上調miR-1247-3p表達對缺氧/復氧誘導心肌細胞損傷的影響

劉曉東，劉曉琴，閆業軍

急性心肌梗死是一種臨床常見的疾病類型，目前采用經皮冠狀動脈介入等手段進行治療，當缺血心肌組織恢復供血后可加重心肌組織損傷，即心肌缺血再灌注損傷[1-2]。相關研究表明，中藥具有抗氧化、抗凋亡等作用，可減輕心肌缺血再灌注損傷[3-4]。金櫻子總黃酮(rosa laevigata michx total flavonoids，RLMTF)可減輕動脈內皮損傷，具有降低大鼠體內的氧化應激反應、保護血管內皮功能的作用[5]。金櫻子總黃酮對缺氧/復氧(H/R)誘導心肌細胞損傷的影響尚未明確。微小RNA(miRNA)在心肌細胞損傷中發揮著重要的調控作用，有研究表明miR-1247-3p在H/R誘導的心肌細胞損傷中表達下調，過表達miR-1247-3p可減輕H/R誘導的心肌細胞損傷[6]。本研究探討金櫻子總黃酮是否通過調控miR-1247-3p表達影響H/R誘導的心肌細胞損傷，以期為金櫻子在心肌缺血再灌注損傷方面的作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 金櫻子購自扶風斯諾特生物科技有限公司；大鼠心肌細胞H9C2購自上海研謹生物科技有限公司；Trizol試劑、cDNA合成及實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)試劑均購自美國Thermo Fisher；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent購自美國Invitrogen；miR-NC、miR-1247-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-1247-3p購自廣州銳博生物；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購自南京建成生物；細胞凋亡檢測試劑盒購自北京Solarbio；兔抗鼠Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9抗體與HRP標記的山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物。

1.2 方法

1.2.1 金櫻子總黃酮提取與制備[7]金櫻子粉碎后過40目篩，取1.0 g粉末置于50 mL離心管內，加入30%乙醇和1%纖維素酶，充分混勻后封口，60 ℃恒溫下水浴90 min，之后置于90 ℃恒溫水浴鍋內，滅活酶30 s，提取金櫻子總黃酮(純度73%)，加入二甲基亞砜(DMSO)溶解后稀釋，濃度分別為0.12 mg/mL、0.24 mg/mL、0.48 mg/mL。

1.2.2 實驗分組 將H9C2細胞接種于不含血清的低糖DMEM培養基，置于37 ℃低氧密閉培養箱(95%N2+5%CO2)內缺氧處理3 h，之后以含10%胎牛血清的高糖DMEM置于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱內復氧處理4 h[8]，作為H/R組。同時將正常培養的H9C2細胞作為Con組。H9C2細胞接種于96孔板(每孔3×103個)，分別加入含有濃度為0.12 mg/mL、0.24 mg/mL、0.48 mg/mL金櫻子總黃酮的培養基，維持24 h后進行H/R處理，分別作為H/R+RLMTF-L組、H/R+RLMTF-M組、H/R+RLMTF-H組。采用脂質體轉染法將miR-NC、miR-1247-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-1247-3p分別轉染至H9C2細胞，轉染成功后，轉染miR-NC、miR-1247-3p mimics的細胞進行H/R處理，轉染anti-miR-NC、anti-miR-1247-3p的細胞，加入0.48 mg/mL金櫻子總黃酮，維持24 h后進行H/R處理，分別作為H/R+miR-NC組、H/R+miR-1247-3p組、H/R+RLMTF+anti-miR-NC組、H/R+RLMTF+anti-miR-1247-3p組。

1.2.3 試劑盒檢測MDA水平與SOD、GSH-Px活性 收集各組H9C2細胞，采用反復凍融法裂解細胞，利用試劑盒嚴格按照說明書檢測MDA水平與SOD、GSH-Px活性。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取各組H9C2細胞在冰磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中洗滌，懸浮于500 μL Binding Buffer，之后在室溫避光處與膜聯蛋白-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)各5 μL，充分反應10 min，應用流式細胞儀檢測各組H9C2細胞凋亡率。

1.2.5 qRT-PCR檢測miR-1247-3p表達水平 采用Trizol試劑從各組H9C2細胞中制備總RNA。反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增，應用羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀檢測Ct值，并采用2-ΔΔCt法計算miR-1247-3p相對表達量。

1.2.6 免疫印跡法(Western Blot)檢測Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白表達量 以500 μL RIPA裂解液從各組H9C2細胞中制備總蛋白，取40 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜、封閉后加入Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9一抗(1∶1 000)與內參GAPDH抗體稀釋液(1∶2000)4℃孵育12h，加入稀釋比為1∶3 000的二抗稀釋液室溫孵育2 h，暗室內曝光顯影，應用Quantity One軟件對Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白條帶進行定量分析。

2 結 果

2.1 金櫻子總黃酮抑制H/R誘導的心肌細胞氧化應激 與Con組比較，H/R組MDA水平升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性降低(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+RLMTF-L組、H/R+RLMTF-M組、H/R+RLMTF-H組MDA水平降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。詳見表1。

表1 金櫻子總黃酮對H/R誘導的心肌細胞氧化應激的影響(±s，n=3)

2.2 金櫻子總黃酮對H/R誘導心肌細胞凋亡的影響 與Con組比較，H/R組細胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平升高(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+RLMTF-L組、H/R+RLMTF-M組、H/R+RLMTF-H組細胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性。詳見圖1、表2。

圖1 金櫻子總黃酮對H/R誘導心肌細胞凋亡的影響 (A為凋亡相關蛋白表達條帶圖；B為心肌細胞凋亡流式圖)

表2 金櫻子總黃酮對H/R誘導心肌細胞凋亡的影響(±s，n=3)

2.3 金櫻子總黃酮對H/R誘導心肌細胞miR-1247-3p表達的影響 H/R組miR-1247-3p表達量較Con組降低(P<0.05)；相較于H/R組，H/R+RLMTF-L組、H/R+RLMTF-M組、H/R+RLMTF-H組miR-1247-3p表達量升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。詳見表3。

表3 金櫻子總黃酮對H/R誘導心肌細胞miR-1247-3p表達的影響(±s，n=3)

2.4 miR-1247-3p過表達保護H/R誘導心肌細胞損傷的影響 與H/R+miR-NC組比較，H/R+miR-1247-3p組MDA水平降低(P<0.05)，SOD活性、GSH-Px活性增強(P<0.05)，細胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平降低(P<0.05)。詳見圖2、表4。

圖2 miR-1247-3p過表達抑制H/R誘導的心肌細胞凋亡(A為miR-1247-3p過表達影響H/R誘導的心肌細胞凋亡相關蛋白表達條帶圖；B為miR-1247-3p過表達和H/R誘導的心肌細胞凋亡流式圖)

表4 miR-1247-3p過表達保護H/R誘導的心肌細胞損傷(±s，n=3)

2.5 干擾miR-1247-3p表達逆轉金櫻子總黃酮(0.48 mg/mL)對H/R誘導心肌細胞損傷的影響 與H/R+RLMTF+anti-miR-NC組比較，H/R+RLMTF+anti-miR-1247-3p組MDA水平升高(P<0.05)，SOD活性、GSH-Px活性減弱(P<0.05)，細胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平升高(P<0.05)。詳見圖3、表5。

圖3 干擾miR-1247-3p表達逆轉金櫻子總黃酮(0.48 mg/mL)對H/R誘導心肌細胞凋亡的影響(A為干擾miR-1247-3p表達、金櫻子總黃酮和H/R誘導的心肌細胞凋亡相關蛋白表達條帶圖；B為干擾miR-1247-3p表達、金櫻子總黃酮和H/R誘導的心肌細胞凋亡流式圖)

表5 干擾miR-1247-3p表達逆轉了金櫻子總黃酮對H/R誘導心肌細胞損傷的影響(±s，n=3)

3 討 論

金櫻子屬于薔薇科，薔薇屬綠灌木的果實，金櫻子總黃酮是其主要活性成分，黃酮類化合物常表現出抑制自由基生成、抗腫瘤等功能，金櫻子總黃酮可抑制氧化應激及炎癥反應，減輕肝組織缺血/再灌注損傷[9]。金櫻子總黃酮可抑制氧化應激、炎癥反應，減輕腎缺血再灌注損傷[10]。金櫻子總黃酮可減輕脂多糖誘導的小鼠肝損傷[11]。但其對H/R誘導心肌細胞損傷的影響尚未明確。本研究結果顯示，H/R誘導的心肌細胞MDA水平升高，SOD、GSH-Px活性降低，與相關研究報道結果[12]相近，提示成功構建心肌缺血再灌注損傷模型。進一步研究顯示，在H/R誘導心肌細胞中，金櫻子總黃酮呈劑量依賴性減輕氧化應激，該結果由MDA水平下調和SOD、GSH-Px活性上調證實。本研究結果表明，H/R誘導的心肌細胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平升高，與相關研究報道結果[13]相近。金櫻子總黃酮可降低H/R誘導心肌細胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平，提示金櫻子總黃酮保護H/R誘導的心肌細胞損傷與抑制細胞凋亡密切相關。

miR-1247-3p在缺氧缺糖/再復氧誘導的神經細胞中表達下調，恢復其表達可減輕細胞凋亡，進而改善細胞缺氧缺糖/再復氧損傷[14]。本研究結果顯示，在心肌細胞中H/R下調miR-1247-3p水平，金櫻子總黃酮可提高H/R誘導心肌細胞miR-1247-3p表達量，且呈劑量依賴性，提示金櫻子總黃酮可能通過上調miR-1247-3p表達，減輕H/R誘導心肌細胞損傷。本研究結果顯示，miR-1247-3p過表達可降低MDA水平和細胞凋亡率，SOD、GSH-Px活性升高；干擾miR-1247-3p表達部分削弱了金櫻子總黃酮抑制H/R誘導的心肌細胞氧化應激及抑制細胞凋亡的結果。上述結果表明，金櫻子總黃酮通過調控miR-1247-3p表達減輕H/R誘導的心肌細胞損傷。

綜上所述，金櫻子總黃酮通過促進miR-1247-3p表達，抑制H/R誘導的心肌細胞氧化應激及凋亡，從而減輕細胞損傷，miR-1247-3p可能作為金櫻子總黃酮減輕心肌缺血再灌注損傷的潛在靶點。具體作用機制仍需進一步深入研究。