miR-433通過JAK2/STAT3信號通路調控氧化應激干預術后認知功能障礙的實驗研究

許瓊冠，歐陽一彬，謝鎮明

術后認知功能障礙(POCD)是全身麻醉后影響中樞神經系統的常見并發癥之一。POCD可延長術后的恢復時間，并長期影響病人的生活質量。60歲以上病人POCD發生率較高，嚴重影響了老年病人的生活能力和生活質量[1]。有研究表明，年齡增加、大手術、心肌梗死史、酒精依賴史、既往存在認知功能障礙為POCD的獨立危險因素[2]。雖然POCD發病機制尚未明確，先前研究表明，炎癥反應、氧化應激、蛋白表達變化、細胞凋亡和中樞膽堿能系統的退化可能是POCD發病的因素[3-4]。迫切需要了解導致POCD的潛在機制，并找到有效的方法保護術后認知功能。酪氨酸激酶2(JAK2)/轉錄激活因子3(STAT3)通路參與較多生理過程，包括炎癥、增殖、分化和發育[5]，可能有助于驅動暴露于細胞因子后神經元的存活反應。有研究證實，JAK2/STAT3通路參與了短暫性局灶性腦缺血后的抗凋亡過程[6]。阿爾茨海默病動物模型中，激活JAK2/STAT3通路改善了空間學習和記憶功能[7]。MicroRNA(miRNA)是一類短鏈非編碼RNA，通過mRNA降解或翻譯在抑制靶基因表達中發揮關鍵作用。目前，在哺乳動物的腦組織中發現了大量的miRNA，其與腦組織發育、神經元分化和高級神經功能(如學習和記憶)有關[8]，同時與神經退行性疾病、精神障礙和腦腫瘤等疾病有關[9]。相關研究顯示，在阿爾茨海默病和帕金森病中，miRNA參與調節神經元細胞周期控制和凋亡[10]，同時參與調節缺血后腦損傷的病理過程[11]。miR-433位于12號染色體上，有研究顯示，miR-433在缺氧條件下可調節神經元的增殖和遷移[12]，提示miR-433在調節神經細胞生物學功能方面具有重要作用。miR-433在POCD的神經發病機制中的作用尚未明確。本研究探討miR-433和JAK2/STAT3信號通路在大鼠術后認知障礙中的確切作用和相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器 SYBR Premix Ex Taq試劑盒(北京優尼康生物科技有限公司)；PrimeScript RT Reagent Kit試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒[寶日醫生物技術(北京)有限公司]；原位末端凋亡(TUNEL)染色試劑盒(Roche公司)；ABI 7500聚合酶鏈式反應(qPCR)系統(Applied Biosystems公司)；BX51顯微鏡(奧林巴斯公司)。

1.2 實驗動物 8周齡雄性SD大鼠，體質量500～600 g，飼養于動物房中(由海南醫學院實驗動物中心提供)，溫度為22～24 ℃，濕度為55%～65%，光照/黑暗周期為12 h，并提供食物和水。所有實驗方案和程序均獲得醫院動物倫理委員會批準。

1.3 POCD大鼠模型的建立和實驗分組 將大鼠隨機分為Control組、POCD組、POCD+NC mimic組、POCD+miR-433 mimic組。術前禁食12 h，大鼠吸入異氟醚(1.5%～2.0%)麻醉，進行氣管插管和機械通氣。整個手術過程中暴露在21%O2、79%N2和1.5%～2.0%異氟醚的混合物中進行麻醉。消毒后，在劍突下緣垂直切開3 cm，解剖左肝葉。探查左肝葉并與根部結扎，隨后切除。使用0.25%布比卡因浸潤切口，3-0縫線縫合。待大鼠恢復意識后，將其送回到動物房。一旦建立大鼠POCD模型，POCD+NC mimic組、POCD+miR-433 mimic組、POCD+miR-433 mimic+Vector組和POCD+miR-433 mimic+pcDNA-JAK2組大鼠分別通過腦室注射將總體積為 2 μL的NC mimic、miR-433 mimic及Vector、pcDNA-JAK2慢病毒注射到海馬中。Control組和POCD組大鼠未接受病毒載體。

1.4 方法

1.4.1 莫里斯水迷宮實驗(Morris) 使用Morris水迷宮實驗評估認知功能。于損傷后5～8 d進行，訓練持續4 d，每日5次實驗。迷宮由一個不銹鋼圓形水池(直徑120 cm，高50 cm)組成，將水池分為4個象限，在西南象限的中央放置一個透明的有機玻璃平臺。將大鼠從4個象限中的一個放入水中自由游泳，探索迷宮，直至找到平臺。若大鼠在60 s內找不到平臺，將其放置在平臺上休息10 s。第5天，移除平臺，將大鼠從東北象限放入水中，讓其游泳60 s，記錄大鼠逃避潛伏期、穿越平臺次數。

1.4.2 蘇木精-伊紅(HE)染色 使用35 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠，解剖大鼠分離腦組織樣本。將腦組織置入4%多聚甲醛中固定24 h，進行常規石蠟包埋。將組織切成厚度為5 μm的連續冠狀切片，之后脫蠟再水合。使用HE染色試劑盒對腦組織進行染色，在光學顯微鏡下觀察腦組織病理變化。

1.4.3 TUNEL染色 按照制造商說明書，使用TUNEL染色試劑盒進行染色。將切片與包括TdT酶和TMRred標記的dUTP在內的TUNEL反應混合物在37 ℃下避光孵育1 h，之后洗滌15 min，使用含有0.03%的3，3′-二氨基聯苯胺(DAB)的轉化過氧化物酶可視化。在BX51顯微鏡下觀察和計數每個切片的5個視野下TUNEL陽性細胞總數。

1.4.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 使用Trizol試劑從海馬組織中提取總RNA。之后用PrimeScript RT Reagent Kit試劑盒和miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒分別從mRNA和miRNA中反轉錄合成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒在ABI 7500 qPCR系統上進行PCR反應。反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，重復40個循環。采用2-ΔΔCt法計算miRNA和mRNA基因的相對表達，U6和GAPDH分別作為miRNA和mRNA的內部對照。

1.4.5 酶聯免疫吸附(ELISA)實驗 收集海馬組織，采用RIPA法分離蛋白，采用二喹啉甲酸法(BCA)試劑盒測定蛋白濃度。根據ELISA試劑盒說明書檢測超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平，使用酶標儀測量450 nm波長各孔的吸光度值。

1.4.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot) 使用RIPA裂解液對處理后的海馬組織進行分裂，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。將50 g蛋白樣品通過8%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將膜在含5%脫脂牛奶的PBST緩沖液中于37 ℃封閉1 h，并與一抗在4 ℃下孵育過夜。之后將膜與相應的辣根過氧化物酶結合的二抗在37 ℃下孵育1 h。使用電化學發光(ECL)試劑盒測量相關蛋白表達水平，并使用Image J軟件進行定量。

1.4.7 雙熒光素酶報告基因實驗 將293 T細胞接種在24孔板中，并與攜帶野生型JAK2(WT-JAK2)或突變型JAK2(MUT-JAK2)的熒光素酶質粒和miR-433 mimic或NC mimic共轉染。孵育48 h后，根據說明書采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光強度。

2 結 果

2.1 miR-433對POCD大鼠認知能力的影響 與Control組比較，POCD組大鼠海馬組織中miRNA-433表達降低，逃避潛伏期延長，穿越平臺次數減少；與POCD+NC mimic組比較，POCD+miR-433 mimic組大鼠海馬組織中miRNA-433表達升高，逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖1。

POCD組與Control組比較，＊P<0.05；POCD+miR-433 mimic組與POCD+NC mimic組比較，#P<0.05。圖1 miR-433對POCD大鼠認知功能的影響(A為miRNA-433表達柱狀圖；B為逃避潛伏期柱狀圖；C為穿越平臺次數柱狀圖)

2.2 miR-433對POCD大鼠海馬組織病理學的影響 HE染色結果顯示：Control組海馬組織神經細胞排列規則緊密，細胞邊界清晰，細胞核呈圓形或橢圓形。POCD組神經細胞紊亂，細胞核溶解，海馬神經元細胞和錐體細胞死亡，壞死神經細胞數量減少。POCD+miR-433 mimic組大鼠海馬內細胞排列較POCD+NC mimic組更規則，壞死神經細胞數量減少。詳見圖2。

圖2 miR-433對POCD大鼠海馬組織病理學變化的影響(HE)

2.3 miRNA-433過表達對神經元細胞凋亡的影響 與Control組比較，POCD組大鼠神經元細胞凋亡率、Cleaved Caspase-3和Bad蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低；與POCD+NC mimic組比較，POCD+miR-433 mimic組大鼠神經元細胞凋亡率、Cleaved Caspase-3和Bad蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖3。

POCD組與Control組比較，＊P<0.05；POCD+miR-433 mimic組與POCD+NC mimic組比較，#P<0.05。圖3 miR-433對POCD大鼠神經元細胞凋亡的影響(A為TUNEL染色圖；B為細胞凋亡率柱狀圖；C為各蛋白表達條帶圖；D為各蛋白表達柱狀圖)

2.4miRNA-433過表達對POCD大鼠海馬組織氧化應激水平的影響 與Control組比較，POCD組大鼠海馬組織SOD水平降低，MDA水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與POCD+NC mimic組比較，POCD+miR-433 mimic組大鼠海馬組織SOD水平升高，MDA水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖4。

POCD組與Control組比較，＊P<0.05；POCD+miR-433 mimic組與POCD+NC mimic組比較，#P<0.05。圖4 miR-433對POCD大鼠海馬組織氧化應激水平的影響 (A為MDA表達柱狀圖；B為SOD表達柱狀圖)

2.5 miR-433靶向JAK2并調控其表達 雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與NC mimic組比較，miR-433 mimic組WT-JAK2細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)；RT-qPCR實驗結果顯示，與NC mimic組比較，miR-433 mimic組JAK2 mRNA和蛋白水平下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖5。

與NC mimic組比較，＊P<0.05。圖5 miR-433靶向JAK2并調控其表達(A為熒光素酶活性柱狀圖；B為JAK2 mRNA表達柱狀圖；C為JAK2蛋白表達條帶圖；D為JAK2蛋白表達柱狀圖)

2.6 miR-433通過JAK2/STAT3通路對POCD大鼠氧化應激和凋亡的影響 與POCD+NC mimic組比較，POCD+miR-433 mimic組大鼠海馬組織中p-JAK2、p-STAT3、Cleaved Caspase-3、Bad蛋白及MDA水平降低，Bcl-2蛋白、SOD水平升高；與POCD+miR-433 mimic+Vector組比較，POCD+miR-433 mimic+pcDNA-JAK2組大鼠海馬組織p-JAK2、p-STAT3、Cleaved Caspase-3、Bad蛋白及MDA水平升高，Bcl-2蛋白、SOD水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖6。

POCD+miR-433 mimic組與POCD+NC mimic組比較，＊P<0.05；POCD+miR-433 mimic+pcDNA-JAK2組與POCD+miR-433 mimic+Vector組比較，#P<0.05。圖6 miR-433通過JAK2/STAT3通路對POCD大鼠氧化應激和凋亡的影響(A為各蛋白表達條帶圖；B為Cleaved Caspase-3、Bad、Bcl-2蛋白表達柱狀圖；C為p-JAK2、p-STAT3蛋白表達柱狀圖；D為MDA表達柱狀圖；E為SOD表達柱狀圖)

3 討 論

POCD主要臨床表現為注意力、記憶、語言等認知功能減退。POCD的病理機制復雜，且尚未明確。在具有學習和記憶功能的大腦海馬體中，信號通路的改變認為是全身麻醉導致POCD認知障礙的上游機制。據報道，異氟醚是一種常見的吸入麻醉劑，通過核轉錄因子(NF)-κB和缺氧誘導因子-1等多種途徑誘導老年大鼠海馬神經炎癥和認知損傷[13]。氧化應激可能參與POCD的發病機制，有研究顯示，手術創傷誘導了POCD模型鼠海馬的氧化應激[14]。這些機制為POCD提供了潛在的預防或治療靶點。已研究證實，在POCD大鼠模型中，抑制氧化應激可改善認知功能障礙[15]。本研究采用異氟醚誘導的大鼠POCD模型，通過測定氧化應激因子、細胞凋亡和JAK2/STAT3信號通路相關蛋白，探討miR-433在大鼠POCD發生和進展中的作用，本研究提供了一種新的POCD治療方法，并探討其作用機制。

Morris水迷宮實驗常用于評估大鼠認知功能，主要是實驗動物空間位置和方向學習記憶能力，廣泛應用于學習記憶、老年癡呆、海馬研究、智力與衰老、新藥研發等方面的研究[16]。逃逸潛伏期用于評估大鼠學習能力，逃逸潛伏期越短，表現越好。穿越平臺次數用于評估空間記憶能力，穿越平臺次數越多提示性能水平越高。本研究將miR-433過表達腺病毒注射至大鼠體內，結果顯示，miR-433過表達改善了POCD大鼠學習和空間記憶能力。

本研究結果顯示，miR-433過表達與海馬MDA降低和SOD水平升高有關，表明miR-433過表達抑制了老年POCD大鼠海馬的氧化應激。氧化應激是指抗氧化防御系統功能障礙，導致活性氧和活性氮過量產生，從而導致組織和細胞損傷[17]。SOD是抗氧化系統中重要的酶，其活性可直接反映線粒體抗氧化系統水平[18]。有研究表明，氧化應激參與了POCD誘導的神經元損傷[1]。有研究顯示，手術創傷可誘導POCD海馬氧化應激，從而參與POCD發病機制，年齡也是POCD的危險因素，年老的海馬表現出多種神經生物學變化，包括氧化應激增加[19]。因此，氧化應激可能是治療POCD的潛在靶點。有研究表明，miR-7684參與調控POCD氧化應激的表達[20]。本研究中，miR-433過表達可降低POCD大鼠氧化應激，抑制神經元凋亡，改善術后認知功能障礙的發生和發展，發揮神經保護作用。

相關研究顯示，JAK2/STAT3信號通路在腦缺血神經元中具有抗炎和抗凋亡作用[21]。JAK2磷酸化或過表達可能是腦損傷的機制之一[22]。減少JAK2/STAT3磷酸化可減少神經元死亡，縮小梗死面積，防止神經細胞缺血后損傷。腦缺血后通過RNA干擾降低了STAT3磷酸化，具有顯著的神經保護作用[23]。有研究顯示，電針刺激大鼠局灶性腦缺血，通過降低JAK2表達，防止JAK2異常激活，下調STAT3磷酸化，從而改善神經功能缺損[24]。JAK2/STAT3通路下調與miRNA上調相關。miR-17通過靶向JAK2/STAT3信號通路，減少膠原誘導關節炎小鼠的炎癥和骨侵蝕[25]。有研究顯示，帕金森病和阿爾茨海默病病人miR-433下調，miR-433過表達可能通過JAK2/STAT3降低Aβ誘導的神經元活性抑制[26]。miR-433通過JAK2/STAT3通路在術后認知障礙中的作用尚未明確。本研究結果顯示，miR-433過表達可能通過JAK2/STAT3通路改善大鼠POCD。

綜上所述，miR-433通過JAK2/STAT3通路調控氧化應激抑制海馬組織的神經元凋亡，改善大鼠認知功能，為治療POCD提供了新方法。