傳染性胰臟壞死病疫苗的研究進展

劉為倫，趙景壯，盧彤巖，邵軼智，任廣明，徐黎明

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023）

傳染性胰臟壞死病（infectious pancreatic necrosis，IPN）是一種高度傳染性疾病，主要危害鮭鱒幼魚。加拿大和美國是最早報導(dǎo)該疾病的國家，后來該疾病在歐洲和亞洲的十多個國家相繼暴發(fā)[1]。20世紀80 年代末IPN 又傳到日本，隨后中國和韓國報導(dǎo)了該疾病[1]。該疾病在我國的遼寧、山西、山東、甘肅等地迅速擴散，給我國鮭鱒魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。該病由傳染性胰臟壞死病毒（infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）引起。該病毒顆粒是一個無囊膜的正二十面體結(jié)構(gòu)，直徑約60 nm[2]。該病毒為雙鏈RNA 病毒，擁有A、B 兩段雙鏈RNA 基因組，A 段基因含有兩個開放閱讀框（ORFs），分別編碼約106 kDa 的pVP2-VP4-VP3 多聚蛋白前體和約15 kDa 的非結(jié)構(gòu)蛋白VP5；B 段基因編碼約94 kDa 的聚合酶蛋白VP1[3]。VP2 蛋白是IPNV 的主要抗原蛋白，其基因組包含了病毒的大部分抗原表位，是研究最多的蛋白，廣泛用于IPNV的檢測、血清型分類、基因分型以及疫苗的研發(fā)[4]。

我國主要通過藥物治療來防控該疾病[5]，而接種疫苗是預(yù)防病毒性疾病最有效的方法。目前已經(jīng)商業(yè)化的IPN 疫苗為挪威Pharmaq 公司生產(chǎn)的IPN滅活疫苗（https://pharmaq.com/），國內(nèi)尚無商業(yè)化的IPN 疫苗。本文綜述了國內(nèi)外IPN 疫苗的研究進展。已經(jīng)報導(dǎo)的IPN 疫苗可分為滅活疫苗、減毒活疫苗、基因工程疫苗（DNA 疫苗、重組亞單位疫苗、活載體疫苗），可通過浸泡、口服和注射等方式接種，其中注射是最有效的接種方式[6]。

1 滅活疫苗

滅活疫苗是通過加熱、紫外線照射等物理方法或通過滅活劑處理等化學(xué)方法使病毒失去活性制備而成[7]。目前，IPN 滅活疫苗的制備主要是通過滅活劑使IPNV 完全喪失活性。滅活劑具有特異性，不同類型的病原體的滅活效果有差別。不同病原使用的滅活劑及滅活條件不同，因此，確定病毒的最佳滅活劑和滅活條件（包括溫度和時間）對制備高效的疫苗非常重要。已有的報導(dǎo)中，IPN 滅活疫苗的研制通常使用甲醛（formaldehyde）和β-丙內(nèi)酯（beta-propiolactone，BPL）兩種滅活劑滅活I(lǐng)PNV。

Hill 等[8]用1∶200 的甲醛溶液4 ℃滅活I(lǐng)PNV 24 h，用1∶250 的BPL 溶液37 ℃滅活I(lǐng)PNV 3 h，將滅活液腹腔注射虹鱒（Oncorhynchus mykiss），產(chǎn)生了較好的免疫保護效果。Dixon 和Hill[9]確定：在20 ℃用1∶200 的甲醛溶液滅活4 d 可完全滅活I(lǐng)PNV；在4 ℃下用1∶200 的BPL 溶液滅活6 d 可完全滅活I(lǐng)PNV。但是，在4 ℃下，用BPL 滅活的病毒抗原損失超過50%，而在20 ℃下用甲醛滅活的抗原損失只有10%～15%，用甲醛滅活的病毒腹腔注射免疫虹鱒后，空斑中和實驗表明該疫苗對虹鱒有保護作用。該研究認為甲醛是滅活I(lǐng)PNV 的首選方法。Bootland 等[10]用1∶200 的甲醛溶液滅活I(lǐng)PNV，并用三種不同濃度的疫苗（3.6×107pfu·mL-1、3.6×108pfu·mL-1和3.6×109pfu·mL-1）浸泡接種8.5 周齡溪鱒（Salvellnus fontinalls），但死亡率卻比未接種疫苗的死亡率高，說明浸泡免疫并沒有保護效果。因此，滅活疫苗一般采用注射的方式免疫，與佐劑混合使用后效果會更好。2012 年Munang’andu 等[11]比較了油佐劑-滅活疫苗、聚乳酸-羥基乙酸（polylactic acidglycolic acid，PLGA）-滅活疫苗、DNA 疫苗以及大腸桿菌（Escherichia coli）-重組亞單位疫苗的保護效果，其中油佐劑-滅活疫苗的保護效果最好，相對保護率可達53.3%。為了確定最佳接種劑量，Munang’andu 等[12]將兩種抗原劑量（2×1010TCID50、2×109TCID50·mL-1）的滅活疫苗均以0.1 mL 腹腔注射接種大西洋鮭（Salmo salar）。結(jié)果顯示，當抗原劑量為2×1010TCID50·mL-1時，滅活疫苗免疫效果更佳。Tamer 等[13]用1∶200 甲醛室溫滅活96 h，與763A 油佐劑1∶1 混合后將抗原劑量調(diào)整為2×1010TCID50·mL-1，滅活疫苗對虹鱒的相對保護率為79%。

2 減毒疫苗

減毒疫苗是指毒力降低的活病毒。該類病毒仍具有良好的抗原性和體內(nèi)復(fù)制能力，在進入宿主后能夠誘導(dǎo)宿主發(fā)生免疫反應(yīng)產(chǎn)生特異性抗體，以預(yù)防強毒株的感染[14]。減毒疫苗的IPNV 毒性弱，不會引發(fā)疾病，但是仍具有活性，進入宿主體內(nèi)可自主復(fù)制，誘導(dǎo)機體長時間的免疫反應(yīng)。前病毒（provirus）是IPNV 毒性最弱的狀態(tài)，是IPNV 在宿主細胞復(fù)制過程中產(chǎn)生的一個低密度的顆粒，里面包裹著病毒基因組RNA。這是IPNV 未成熟的狀態(tài)，該顆粒可以通過碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）抑制多蛋白成熟獲得[15]。Rivas-Aravena 等[15]用前病毒免疫虹鱒，產(chǎn)生了與IPNV 感染相似的細胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，前病毒組中和抗體水平更高，病毒載量降低顯著。這表明用前病毒制作減毒疫苗是一個很好的策略。

有研究發(fā)現(xiàn)，IPNV 毒株在大西洋鮭中的毒力決定基因位于VP2 氨基酸序列上第217、221 和247 位上的氨基酸殘基，當221 位上的氨基酸是蘇氨酸時，病毒不具有毒性[16,17]。可以根據(jù)這一特點，改造IPNV VP2 上的毒力基因來減弱病毒的毒性，以制備減毒疫苗。Munang’andu 等[17]將IPNV VP2上的第217 位氨基酸突變?yōu)楦彼幔≒）、221 位氨基酸突變?yōu)樘K氨酸（T）、247 位氨基酸突變?yōu)楸彼幔ˋ）獲得無毒的毒株，可以誘導(dǎo)大西洋鮭產(chǎn)生較高的抗體水平。

減毒疫苗在接種后會殘留一些毒力，這些毒力雖然不致病，但是在進入魚體后可能會存在毒力返強的風險，一定程度上導(dǎo)致其應(yīng)用受限[18]。

3 基因工程疫苗

隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，可以人工構(gòu)建含有抗原基因的重組體，利用構(gòu)建的重組體自身或者其表達產(chǎn)物制備出成本低、無致病性、安全性高的新型疫苗[19]。基因工程疫苗可將多個病原的抗原基因連接在一起，制備可同時預(yù)防多種疾病的多價疫苗，這比傳統(tǒng)的滅活疫苗和減毒疫苗更有優(yōu)勢[20]。研發(fā)基因工程疫苗首先要確定IPNV 的抗原表位。Frost 等[21]對IPNV 抗原表位的定位發(fā)現(xiàn)，IPNV 的抗原表位位于基因VP2 和VP3 上，而VP2 基因含有主要的抗原表位，因此常用VP2 研發(fā)疫苗。Park等[22]比較了IPNV VP2 和VP3 的免疫原性，發(fā)現(xiàn)VP3 更具有免疫原性。因此，IPN 基因工程疫苗的研制有兩種方法：一是構(gòu)建VP2 或者VP3 的重組蛋白制備疫苗，二是構(gòu)建VP2-VP3 融合蛋白制備疫苗。IPN 的基因工程疫苗包括：DNA 疫苗、重組亞單位疫苗以及活載體疫苗。

3.1 DNA 疫苗

DNA 疫苗是指利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的重組質(zhì)粒，通過不同遞送系統(tǒng)使其在動物體內(nèi)表達，使機體發(fā)生免疫反應(yīng)而起到保護效果[23]。DNA 疫苗比重組亞單位疫苗制備更簡單，不需要在體外表達，構(gòu)建重組質(zhì)粒后，可以利用感受態(tài)細胞進行擴繁，然后大量提取重組質(zhì)粒，制備成本低、周期短，成為研究最多的疫苗。本文從DNA 疫苗的免疫方式即注射疫苗和口服疫苗兩個方面總結(jié)了已經(jīng)報導(dǎo)的DNA 疫苗。

3.1.1 注射疫苗

Mikalsen 等[24]基于IPNV 的多聚蛋白基因（含VP2 和VP3）、VP2 的前端、VP2 的中心部分、VP2 的后端、VP2 以及VP3 構(gòu)建了6 種質(zhì)粒。將6 種質(zhì)粒通過肌肉注射分別接種大西洋鮭。結(jié)果僅有含IPNV 多聚蛋白基因組的質(zhì)粒獲得了較好的保護效果，相對保護率達到84%，而VP2 作為主要的抗原基因并沒有良好的保護效果，可能是因為通過截短的方式獲取VP2 時造成了連續(xù)表位的丟失。De Las Heras 等[25]將VP2 插入到pcDNA3.1 表達載體中，該重組質(zhì)粒可以減少IPNV 感染后的細胞病變效應(yīng)以及病毒載量。免疫褐鱒（Salmo trutta）后，相關(guān)免疫基因的表達量急劇增加，還能檢測到IPNV 特異性抗體。Cuesta 等[26]將IPNV A 片段多聚蛋白開放閱讀框（ORF）插入到pcDNA3.1 表達載體中，構(gòu)建了針對IPNV 的DNA 疫苗（pIPNV-PP）。該疫苗可明顯減少虹鱒體內(nèi)IPNV 病毒載量。Xu 等[27]將IHNV的糖蛋白基因和IPNV 的VP2-VP3 克隆到pcDNA3.1 表達載體中，對IHNV 和IPNV 混合感染有明顯的保護作用。該疫苗接種劑量小，只需要1 μg質(zhì)粒DNA 就可為虹鱒提供良好的保護效果。Ahmadivand 等[28]用帶有PTA 基序的VP2 的DNA 疫苗免疫4～5 g 的虹鱒，結(jié)果顯示出88%的相對保護率。帶有PTA 基序的IPNV 無毒，雖然不具毒性，但病毒仍具有抗原性，可以用于研制高效的DNA 疫苗。

3.1.2 口服疫苗

口服疫苗比注射疫苗接種更方便，對幼魚無損傷，更合適小魚的大規(guī)模接種。口服給藥后，疫苗中的抗原基因首先要經(jīng)過消化道，為了保證疫苗不被完全消化而順利通過消化道，需要采取一定的保護方法[29]。在IPN 口服疫苗的研發(fā)中，通常采用藻酸鹽、脂質(zhì)體以及殼聚糖等疫苗遞送載體保護抗原基因，保證抗原基因不被降解而被魚苗充分吸收，達到免疫效果。

用藻酸鹽微球?qū)①|(zhì)粒DNA 包裹，可以避免疫苗在消化道被消化，順利進入魚體前腸和后腸，保證疫苗被充分吸收。De Las Heras 等[30]用藻酸鹽微球膠囊封裝帶有VP2 的DNA 疫苗，保護效果可達80%。Ballesteros 等[31]發(fā)現(xiàn)，藻酸鹽口服DNA 疫苗誘導(dǎo)的保護機制與IPNV 感染誘導(dǎo)的防御機制相似，而口服疫苗誘導(dǎo)的相關(guān)免疫因子上調(diào)量更高。將該疫苗和飼料混合后連續(xù)喂養(yǎng)虹鱒3 d，對虹鱒的相對保護率可達85.9%[32]。該研究表明將疫苗與飼料混合投喂是一種很有效的接種方式。

脂質(zhì)體是由雙層磷脂組成的球形封閉結(jié)構(gòu)，能包裹質(zhì)粒DNA 而起到保護抗原的作用，廣泛應(yīng)用于疫苗的研究中[33]。Reyes 等[34]用陽離子脂質(zhì)體將DNA 疫苗制成丸劑連續(xù)喂養(yǎng)虹鱒5 d，相對保護率可達66%，明顯好于肌肉注射（47.8%）。殼聚糖也是口服疫苗的載體之一[33]。Ahmadivand 等[35]用殼聚糖/ 三聚磷酸（chitosan/tripolyphosphate，CS-TPP）納米顆粒包裹質(zhì)粒DNA，以每尾魚10 μg DNA 和25 μg DNA 的劑量口服免疫虹鱒魚苗，相對保護率為47%和70%。在口服相同劑量的CS-TPP 納米顆粒和藻酸鹽微球配制的DNA 疫苗后，相對保護率上升為59%和82%。這些結(jié)果表明了CS-TPP 納米顆粒作為口服疫苗遞送載體的潛力，與藻酸鹽微球膠囊配合使用效果更佳。

3.2 重組亞單位疫苗

重組亞單位疫苗是指利用相應(yīng)的表達載體，使抗原基因在對應(yīng)的表達系統(tǒng)中表達，獲得使機體產(chǎn)生特異性免疫或非特異性免疫的抗原蛋白[19]。目前用于IPNV 亞單位疫苗的原核表達系統(tǒng)包括大腸桿菌表達系統(tǒng)和乳酸桿菌表達系統(tǒng)；真核表達系統(tǒng)包括昆蟲細胞表達系統(tǒng)和釀酒酵母表達系統(tǒng)。

大腸桿菌表達系統(tǒng)是研制重組亞單位疫苗最常用的表達系統(tǒng)，具有制備周期短、成本低、蛋白產(chǎn)量高、技術(shù)成熟等優(yōu)點。乳酸桿菌是腸道里的有益菌，是一種安全的微生物，代表菌株有干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）等，以乳酸桿菌為表達系統(tǒng)的口服疫苗安全性會更好。利用酵母和昆蟲細胞表達的VP2 和VP3蛋白，可以形成一種病毒樣顆粒（virus-like particles，VLP）。VLP 具有與天然病毒相似的三級結(jié)構(gòu)，能夠更有效地誘導(dǎo)抗IPNV 反應(yīng)[36]。與VLP 相似的還有亞病毒顆粒（subviral particles，SVP）。它們具有病毒的自身免疫原性和生物活性，但是不帶有病毒的遺傳物質(zhì)，不具有傳染性，是一種安全有效的疫苗形式。

3.2.1 大腸桿菌表達系統(tǒng)

Manning 和Leong[37]用質(zhì)粒pTA1 在大腸桿菌中表達了IPNV A 段編碼的完整cDNA，獲得了大量IPNV 蛋白。用細菌裂解物浸泡免疫虹鱒，攻毒后虹鱒的死亡率為4%，而對照組死亡率達到44%。該研究說明亞單位疫苗可以為魚苗提供實質(zhì)性的保護。Frost 等[38]在大腸桿菌中表達了重組VP2 蛋白，可在大西洋鮭體內(nèi)產(chǎn)生IPNV 特異性抗體。Dadar 等[39]構(gòu)建了IPNV VP2-VP3 融合基因的重組質(zhì)粒，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)在體外表達，獲得了高產(chǎn)量的VP2-VP3 重組蛋白。用該重組蛋白注射方式虹鱒，相對保護率可達83%。Tamer 等[13]利用大腸桿菌表達IPNV VP2 蛋白，結(jié)合ISA 763A 佐劑制備重組亞單位疫苗，對虹鱒的相對保護率為70%。

3.2.2 乳酸桿菌表達系統(tǒng)

劉敏等[40]利用pPG1 表達載體在干酪乳桿菌中表達了IPNV VP3 基因，為之后研制乳酸桿菌口服疫苗奠定了基礎(chǔ)。Zhao 等[41]構(gòu)建了pPG1-VP2-VP3 重組質(zhì)粒，在干酪乳桿菌表達，獲得了pPG1-VP2-VP3 重組蛋白。該疫苗可誘導(dǎo)虹鱒體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗血清IgM，并降低IPNV 在虹鱒體內(nèi)的載量。這些研究表明，乳酸桿菌表達系統(tǒng)可用作疫苗設(shè)計。劉佳琪等[42]從虹鱒腸道中分離出了一種植物乳桿菌，并利用分離出的植物乳桿菌表達了IPNV VP2-VP3重組蛋白，經(jīng)過初次免疫和加強免疫后，對虹鱒的保護率可達100%，表明利用虹鱒體內(nèi)分離出來的宿主菌研制疫苗的保護效果更好，為口服疫苗的開發(fā)提供了新的思路。Duan 等[43]在干酪乳桿菌的疫苗基礎(chǔ)上加入虹鱒趨化因子CK6，誘導(dǎo)了虹鱒體內(nèi)更強烈的特異性免疫反應(yīng)，保護效果更好。Chen 等[29]在加入了CK6 疫苗的基礎(chǔ)上添加嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）黏附基因（AHA1）。將AHA1 作為腸上皮細胞的靶向分子，能黏附在上皮細胞并延長抗原在腸道內(nèi)的保留時間，增強乳酸菌疫苗的免疫原性。在加入AHA1 后，口服免疫能更迅速、更精確地將IPNV VP2 蛋白送到腸上皮細胞，使機體產(chǎn)生顯著水平的抗IPNV 血清IgM 和黏膜IgT 抗體應(yīng)答。干酪乳桿菌在和靶向分子、趨化因子聯(lián)合使用后，保護效果良好。但是構(gòu)建乳酸桿菌疫苗通常使用抗生素耐藥性作為選擇性標志物，會對生物安全構(gòu)成威脅。Hua 等[44]去掉了pPGF-612 中的氯霉素基因，將其作為載體在干酪乳桿菌中表達了以EGFP 綠色熒光蛋白為標記的CK6-VP2 融合蛋白，該疫苗可有效抑制IPNV 在虹鱒體內(nèi)的復(fù)制。在未來的一段時間，乳酸桿菌疫苗的研制主要以無抗生素疫苗為主。

3.2.3 酵母表達系統(tǒng)

Allnutt 等[45]在釀酒酵母中表達了IPNV VP2 基因，VP2 基因在酵母中形成了一種20 nm 的SVP。將rVP2-SVP 通過注射和口服兩種途徑接種虹鱒，檢測到了IPNV 特異性抗體，用IPNV Buh 毒株對虹鱒攻毒，接種疫苗組病毒載量比對照組更低。該研究證明了SVP 作為疫苗開發(fā)的潛力。Dhar 等[46]將人類致癌基因c-myc 插入到IPNV VP2 蛋白自組裝的SVP 中，在釀酒酵母中成功表達，并在虹鱒體內(nèi)誘導(dǎo)了抗IPNV 免疫反應(yīng)。賀文斌[47]建立了IPNV酵母表面展示系統(tǒng)，將IPNV VP2 蛋白在酵母表面成功表達，用該疫苗免疫虹鱒發(fā)現(xiàn)，免疫虹鱒IgM、IgT、CD4、CD8 等免疫基因均顯著上調(diào)；虹鱒體內(nèi)IPNV 載量顯著降低。這些結(jié)果表明，釀酒酵母是一種非常好的疫苗表達系統(tǒng)，以釀酒酵母研發(fā)的IPNV 口服疫苗具有較好的免疫效果。

3.2.4 昆蟲細胞表達系統(tǒng)

昆蟲表達系統(tǒng)是將抗原基因整合到桿狀病毒中，隨桿狀病毒在昆蟲細胞中大量繁殖獲得高產(chǎn)量的蛋白。桿狀病毒的宿主專一性強，通常不會造成實驗室的污染，安全性較高[35]。Shivappa 等[48]利用桿狀病毒在昆蟲細胞和幼蟲中表達了IPNV 的A 片段，獲得了高產(chǎn)量的IPNV 蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白自組裝形成VLP。用獲得的VLP 抗原加上油佐劑制成疫苗免疫大西洋鮭，相對保護率為27%。該研究結(jié)果表明，昆蟲表達系統(tǒng)可用于IPNV 疫苗的研制。

3.3 活載體疫苗

活載體疫苗是將抗原基因通過基因工程技術(shù)插入到弱毒或者無毒的毒株中構(gòu)建重組病毒。重組病毒可通過浸泡或者自然感染的方式將目的基因運送到宿主體內(nèi)，隨著重組病毒在宿主體內(nèi)不斷繁殖，目的基因也隨之不斷表達，誘發(fā)相應(yīng)的免疫反應(yīng)[49]。Guo 等[50]用IPNV VP2 基因和VP2 CEO 基因替代IHNV 的NV 基因，構(gòu)建了兩種重組病毒（rIHNV-IPNV VP2 和rIHNV-IPNV VP2 COE），兩種重組病毒對虹鱒魚苗的保護效果可達50%～65%。Chen 等[51]用IPNV 的VP2 基因取代了rIHNV 主鏈的NV 基因，構(gòu)建rIHNV-N438A-ΔNV-VP2 重組病毒。該重組病毒對IPNV Sp 血清型感染的相對存活率可達88.9%。Zhao 等[52]將IPNV 的VP2 基因插入到IHNV U 型基因組的Blk94 毒株的P 和M 基因之間，構(gòu)建了rBlk94-VP2 重組病毒。該重組病毒可顯著降低IPNV 在脾臟、肝臟和前腎中的載量。以上研究都表明，IHNV 的弱毒毒株可作為活疫苗開發(fā)的載體，保護虹鱒免受兩種或多種疾病的感染，廣泛應(yīng)用在IPN 疫苗研制中。Li 等[53]將VP2 基因整合到腺病毒中，該重組病毒在人胚腎細胞（human embryonic kidney cells，HEK-293）中成功表達VP2基因。用重組病毒浸泡免疫虹鱒，相對保護率可達88.24%。以腺病毒為載體開發(fā)出的IHNV 和IPNV的二聯(lián)活載體疫苗，浸泡免疫虹鱒，IPNV 攻毒后的相對存活率可達86.84%[54]。

活載體疫苗接種方便，可通過自然感染的方式接種魚苗，容易引起群體免疫。在進入宿主體內(nèi)后，抗原基因會隨著載體在體內(nèi)復(fù)制，可以引起長時間的免疫反應(yīng)，且免疫效果好，這些優(yōu)勢讓活載體疫苗成為一類新型疫苗。

4 展望

近年來，IPN 的暴發(fā)使我國鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)遭受到了嚴重的阻礙。大多數(shù)疫苗停留在實驗室水平，沒有商業(yè)化產(chǎn)品投入市場。目前，IPN 滅活疫苗的制備技術(shù)已經(jīng)成熟，最佳滅活方式、最佳接種劑量以及最佳免疫方式已經(jīng)確定，最有可能成為首批商業(yè)化疫苗。與此同時，基因工程疫苗已取得突破性進展。基因工程是新時代的產(chǎn)物，各地區(qū)對基因工程疫苗的態(tài)度以及政策各不相同，其應(yīng)用受到一定得限制。隨著人們對漁用疫苗的認識加深及基因工程的飛速發(fā)展，將有希望獲得更加便捷、安全、高效的IPN 疫苗，促進鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。