亞精胺對鹽脅迫下黃華占水稻幼苗根系抗氧化酶活性及Na+穩態的影響

黃婷婷 鄭殿峰 馮乃杰 趙黎明 周鴻凱 沈雪峰*

（1 廣東海洋大學 濱海農業學院，廣東 湛江 524088；2 國家耐鹽堿水稻技術創新中心 華南中心，廣東 湛江 524088；*通訊作者）

近年來，土壤鹽漬化問題已經引起國內外學者的廣泛關注，全球20%以上的耕地受到鹽脅迫的影響，且數量還在增加[1]。其中，中國鹽漬土總面積為3.6×107hm2，占可耕地總面積的4.88%，且還有9.2×107hm2的耕地正面臨著鹽漬化的危害[2]。全球農業正面臨重大挑戰，到2050 年，全世界將新增23 億人口，糧食作物產量需增加70%[3]。可見，鹽脅迫是限制糧食作物生產的重要問題，是世界范圍內影響作物產量的最重要環境壓力之一。

水稻是全球重要的糧食作物之一，也是對鹽脅迫較為敏感的作物，隨著全球氣候變暖及生態環境不斷惡化，水稻生長過程中遭受干旱、高鹽等非生物脅迫在增加[4]。鹽脅迫作為主要的非生物脅迫之一，嚴重影響水稻的生長發育[5]。植物鹽脅迫一般表現為滲透脅迫和離子毒害兩個階段，引起植株體內活性氧破壞、膜系統損傷、光合和呼吸作用受抑制、酶活性降低等，表現為植株矮小、葉片黃化，最終導致糧食產量、品質的下降[6-7]。多胺（Polyamines，PAs）主要包括腐胺（二胺，Putrescine，Put）、亞精胺（三胺，Spermidine，Spd）和精胺（四胺，Spermine，Spm），是生物代謝過程中產生的一類具有生物活性的低分子量脂肪族含氮堿，廣泛作用于高等植物的生長發育、形態建成、防止衰老、抵抗環境脅迫等方面[8]。大量研究表明，外源Spd 能夠在一定程度上緩解鹽脅迫對植物生長的抑制效應[9-12]。但目前關于鹽脅迫條件下施用外源Spd 對水稻根系生長的影響報道較少。本文以水稻為研究對象，探討在鹽脅迫下外源Spd 對水稻幼苗根系的抗氧化防御和Na+穩態的影響，為鹽脅迫下水稻的科學栽培提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻品種為黃華占，由廣東省農業科學院水稻研究所提供。化學試劑有：2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2,7 -Dichlorodi -hydrofluorescein diacetate,DCFH-DA）和二氫乙啶（Dihydroethidium, DHE），購于北京索萊寶科技有限公司；羥基苯基熒光素（HPF）和SBFI AM（Na+Indicator）鈉離子指示探針，購于上海懋康生物科技有限公司。

1.2 試驗設計

本試驗于2021 年3 月至7 月在廣東海洋大學興農樓112 室進行。挑選籽粒飽滿、大小相似的水稻種子，經5%的過氧化氫消毒15 min 后，用去離子水沖洗3～5 遍，置于恒溫培養箱中（28 ℃）培養并催芽1 d，從中挑選露白一致的種子，將其放置于含有1/2 倍Hoagland 營養液發芽盒中進行培養。

試驗分為3 部分進行：①NaCl 對水稻幼苗根系的影響。水稻種子催芽1 d 后，取露白一致的種子，分別定植于含有0、25、50、100、150 和200 mmol/L NaCl 濃度梯度的1/2 Hoagland 營養液的發芽盒中進行培養，設置6 次重復，72 h 后取樣、測定植株生長指標。②外源Spd 對NaCl 脅迫下水稻幼苗根系生長的影響。水稻種子催芽1 d 后，依據試驗①篩選出的鹽濃度，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4 和0.5 mmol/L Spd 溶 液 的1/2 Hoagland 營養液的發芽盒中培養，試驗設置5 次重復，72 h 后取樣，測定植株生長指標。③外源Spd 對鹽脅迫下水稻幼苗根系的抗氧化防御和Na+穩態的影響。水稻種子催芽1 d 后，依據試驗①和試驗②篩選出的NaCl濃度和Spd 濃度，設置4 個處理：僅用營養液（CK）、0.1 mmol/L Spd、100 mmol/L NaCl、100 mmol/L NaCl + 0.1 mmol/L Spd。每個處理5 次重復，120 h 后測定根長，并取根樣進行生理分析和組織化學檢測。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 組織化學檢測

分別采用熒光探針DCFH-DA、DHE、HPF 檢測水稻幼苗根尖細胞中的總ROS、·O2-、H2O2含量。應用鈉離子指示探針測定幼苗根尖細胞中的Na+含量[13-14]。

1.3.2 生理指標

于水稻培養72 h 后，進行根系取樣，立即置于液氮中速凍，移至-20 ℃冰箱保存，待測。通過測定硝基藍四唑（NBT）的光化學還原測定SOD 活性：反應混合物（3 mL）由酶提液（30 μL）、PBS（50 mmol/L, pH 7.8）、EDTA（3 mmol/L）、核黃素（60 μmol/L）、NBT（2.25 μmol/L）和甲硫氨酸（14.5 mmol/L）組成。測定560 nm 波長下的吸光度，計算SOD 活性（1 單位）作為酶促量，得到最大NBT 還原抑制量的一半。

通過測定CAT 對H2O2的分解能力來測定其活性：將30%的H2O2加入含50 mmol/L、pH 7.8、10 mL 的PBS 和酶提液的反應混合液中，立即記錄在240 nm 處的吸光度。CAT 活性以每分鐘分解H2O2（1 mol）的酶量來量化。

通過測定POD 對H2O2的氧化能力來測定其活性：將愈創木酚加入PBS（pH 6.0，0.2 mol/L）緩沖液中，于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至溶解，待溶液冷卻后加入19 μL 30%的H2O2。取3 mL 反應液并加入40 μL 酶液后，通過測定470 nm 下吸光值變化，測定過氧化物酶活性。

根據丙二醛（MDA）在高溫、酸性條件下與硫代巴比妥酸（TBA）反應，形成在532 nm 波長處有最大光吸收的三甲基復合物。分別于450、532 和600 nm 波長下測定OD 值，確定MDA 含量。

1.3.3 數據處理

采用Image pro-plus 6.0 對熒光圖片進行定量分析，經SPSS 23.0 進行方差分析，由Excel 2013 作圖，進行單因素方差（ANOVA）的Duncan 顯著性分析（p<0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同濃度NaCl 和Spd 對水稻幼苗根系生長的影響

由圖1 可知，隨著NaC1 濃度的升高，水稻幼苗的根長呈現先升高后降低的趨勢。其中，25 mmol/L NaC1處理下根長最長，與對照相比，50、100、150 和200 mmol/L NaC1 處理下根長顯著降低，分別下降86.95%、91.83%、93.37%和94.24%。鹽脅迫條件下，施用外源Spd 水稻幼苗的根長均有不同程度增加，且隨著Spd濃度增加呈先上升后下降趨勢（圖2）。與對照相比，施用0.10 mmol/L Spd 處理的水稻幼苗根長增加13.38%，達到顯著水平；而施用0.50 mmol/L Spd 處理抑制作用最強，根長與對照相比顯著降低25.75%。因此，選擇100 mmol/L NaCl 和0.10 mmol/L Spd 作為后續試驗處理濃度。

圖1 不同濃度NaCl 對水稻幼苗根系生長的影響

圖2 不同濃度Spd 對鹽脅迫下水稻幼苗根系生長的影響

2.2 外源Spd 對鹽脅迫下水稻幼苗根系生長的影響

由圖3 可以看出，與對照相比，NaCl 處理水稻幼苗根長顯著下降23.79%。與NaCl 處理相比，Spd+NaCl 處理幼苗根長顯著增加14.62%。說明外源Spd 能夠緩解鹽脅迫對水稻根系生長的抑制作用。

圖3 外源Spd 對鹽脅迫下水稻幼苗根系生長的影響

2.3 外源Spd 對鹽脅迫下水稻幼苗根系中ROS、·O2-、H2O2 生成的影響

由圖4 可知，與對照相比，NaCl 處理下水稻幼苗根系的DCF（2',7'-二氯熒光素）熒光密度增加120.51%，幼苗根系中H2O2和·O2－水平分別增加29.52%和18.68%，均達到顯著水平；與NaCl 處理相比，Spd+NaCl處理下幼苗根系的DCF 熒光密度顯著降低31.54%，H2O2水平和·O2-水平顯著降低16.39%和14.36%。可見，外源Spd 能夠在一定程度上抑制NaCl 誘導的ROS在水稻幼苗根系中的積累。

圖4 外源Spd 對鹽脅迫下水稻幼苗根系中H2O2、·O2-和ROS的影響

2.4 外源Spd 對鹽脅迫下水稻幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖5 可以看出，與對照相比，NaCl 處理水稻幼苗根系中的CAT 和POD 活性分別顯著降低54.28%和20.36%；與NaCl 處理相比，Spd+NaCl 處理幼苗根系中的CAT 和POD 活性分別顯著升高36.21%和22.25%。但不同處理間的SOD 酶活性差異不顯著。可見，外源Spd 能夠在一定程度抑制NaCl 誘導的水稻幼苗根系抗氧化酶活性，提高其清除體內活性氧能力，有效降低氧化傷害程度。

圖5 外源Spd 對鹽脅迫下水稻幼苗根系抗氧化酶活性的影響

2.5 外源Spd 對鹽脅迫下水稻幼苗MDA 含量的影響

由圖6 可以看出，與對照相比，NaCl 處理水稻幼苗根系中的MDA 含量顯著增加149.88%；與NaCl 處理相比，Spd+NaCl 處理幼苗根系中MDA 含量顯著降低31.01%。這說明外源Spd 能有效降低鹽脅迫下活性氧引起的傷害，進而緩解膜脂過氧化傷害，降低細胞膜的受損程度。

圖6 外源Spd 對鹽脅迫下水稻幼苗根系MDA 含量的影響

2.6 外源Spd 對鹽脅迫下水稻幼苗Na+的影響

由圖7 可知，與對照相比，NaCl 處理水稻幼苗根系中Na+熒光密度顯著增加35.52%。與NaCl 處理相比，Spd+NaCl 處理根系中Na+熒光密度顯著下降13.31%。說明外源Spd 可以減少根系中過多的Na+，從而維持細胞穩態。

圖7 外源Spd 處理對鹽脅迫下水稻幼苗根系Na+熒光密度的影響

3 討論

鹽脅迫是限制水稻生長和產量形成的主要非生物脅迫之一[15]。大量研究表明，鹽脅迫抑制水稻種子的萌發、幼苗的生長和根系的建成[6-7，11]。本研究中，50 mmol/L及以上濃度NaCl 處理顯著降低水稻幼苗的根長，這與王燕等[9]的報道一致。

Spd 作為一種生理活性物質，在參與調控植物各種抗逆性中發揮重要作用[16]。研究發現，施用外源Spd提高幼苗抗氧化和滲透調節能力，維持葉片PSII 的活性和電子傳遞鏈的穩定性，提高光合作用，減輕離子毒害，有效提高水稻、燕麥、甜高粱等作物的耐鹽性[9-12]。本試驗中，在100 mmol/L NaCl 條件下，施加0.10 mmol/L Spd 能夠緩解鹽脅迫誘導的根系生長抑制效應，這與李瑤等[7]采用調環酸鈣提高水稻幼苗鹽脅迫的研究結果一致。

在非生物逆境脅迫下，植物體內大量積累活性氧（ROS），而過量的活性氧往往引起蛋白質、脂質、碳水化合物甚至DNA 的破壞，造成植物細胞嚴重損壞甚至死亡[17-18]。本研究發現，與對照相比，NaCl 處理下水稻幼苗根系的ROS、·O2－和H2O2的含量顯著上升，且MDA 水平也隨著升高。這與鄒芳等[12]鹽脅迫處理甜高粱的結果一致。抗氧化酶是植物體內ROS 清除系統，主要通過SOD、CAT 和POD 保護酶發揮作用，平衡細胞內部的ROS[6]。首先由SOD 將·O2－歧化為H2O2和O2，再經CAT 和POD 將H2O2轉化為H2O 和O2。本研究中，SOD 酶活性無變化，而CAT 和POD 酶活性顯著降低，這與劉玲等[9]研究結果一致。本研究中，在100 mmol/L NaCl 條件下，施加0.1 mmol/L Spd 處理能夠顯著增強水稻幼苗根系中SOD、POD 和CAT 活性，MDA含量同步下降，這與海霞等[10]的研究結果一致。

在鹽脅迫條件下，保持植株體以及細胞內的離子平衡是至關重要的。鹽生植物可以通過自身的Na+排除和Na+分隔來解毒過量的Na+[19]。本研究中，在100 mmol/L NaCl 條件下，施加0.1 mmol/L Spd 處理可以顯著降低水稻幼苗根系中Na+的含量，這與海霞等[10]的報道一致。

4 結論

綜上所述，在100 mmol/L NaCl 條件下，施加0.1 mmol·L-1Spd 處理，顯著提高水稻幼苗根系中SOD、POD、CAT 等抗氧化酶活性，降低ROS、·O2－和H2O2含量、MDA 生成量和Na+含量，減輕鹽脅迫下的氧化損傷，維持細胞膜穩定性。可見，0.10 mmol/L Spd 處理可以修復水稻幼苗因滲透脅迫和離子毒害引起的傷害，維持生理代謝和生化反應的穩定狀態，以增強水稻幼苗根系的抗鹽性。