18β-甘草次酸對K19-C2mE自發胃腫瘤轉基因鼠的干預效果及對COX-2、IL-1β表達的影響

段君 許海 沈峰

胃癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，2018年國家癌癥中心發布的數據顯示，我國2015年胃癌的發生率及死亡率分別為29.31/10萬、21.16/10萬，位居全部惡性腫瘤的第2、3位[1]。胃癌預后較差，預防胃癌的發生、進展成為臨床研究的難點。胃癌發病原因復雜，目前認為胃部慢性炎癥狀態是導致部分胃癌發生發展的關鍵環節[2]。18β-甘草次酸是甘草的重要成分，藥理學研究表明，18β-甘草次酸具有消炎、抗潰瘍的作用，體外研究表明，18β-甘草次酸可對腫瘤細胞的生長、增殖有一定抑制效果[3,4]。當前18β-甘草次酸在生物體內的腫瘤抑制效應研究較少，本研究以K19-C2mE自發胃腫瘤轉基因鼠作為研究材料，給予18β-甘草次酸干預，分析小鼠胃黏膜病理變化及環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)表達情況，探討18β-甘草次酸抑制腫瘤生長的機制，為臨床提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 K19-C2mE轉基因種鼠(日本熊本大學實驗動物中心，動物合格證號：OS150CARDID:709，動物使用許可證:SYXK(鄂)2017-0067)、C57BL/6N小鼠[湖北省實驗動物研究中心，動物生產許可證號:SCXK(鄂)2020-0018]均在湖北中醫藥大學實驗動物中心繁殖飼養；小鼠體重為20.0～30.0 g，正式試驗前在溫度21～24℃、濕度54%～66%的環境下單籠飼養。

1.2 實驗藥物 18β-甘草次酸，購自西班牙SIGM-ALDRICH公司，純度97%；兔抗鼠CD34多克隆抗體，武漢博士德公司；Envision試劑，丹麥Dako公司；兔抗人COX-2抗體、兔抗人IL-1β抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標記抗鼠IgG抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.3 動物分組及處理 選取K19-C2mE轉基因鼠與C57BL/6N小鼠交配，獲取子代小鼠，3周齡剪尾進行基因鑒定，選擇K19-C2mE轉基因子代小鼠作為后續研究動物。選取40只狀態良好的K19-C2mE轉基因子代小鼠，隨機分為模型組(20只)、干預組(20只)；另擇20只野生型C57BL/6N小鼠作為對照組。對照組和模型組小鼠正常飲水，干預組小鼠6周齡時給予0.1%18β-甘草次酸水溶液作為飲水，3組小鼠每周稱量體質量，生長至52周時觀察小鼠胃腫瘤情況，記錄腫瘤發生率；取小鼠胃黏膜組織，采用免疫組化方法檢測微血管密度(microvessel density,MVD)，采用蛋白印記雜交測定COX-2、IL-1β表達情況。

1.4 方法

1.4.1 動物標本采集：取適量分析純乙醚進行麻醉處理，小鼠呼吸消失后固定在手術板上，腹部消毒，剪開皮膚暴露腹腔，辨認食管、胃、十二指腸等器官，生理鹽水沖洗腹腔內壁。分離胃周結締組織，小心取下全胃，采用磷酸緩沖液(PBS)反復沖洗胃組織，去除胃內食物殘渣，將胃部展平，剪下小塊胃壁置入凍存管內，立即放入液氮凍存；剩余胃壁組織展開后固定，置入10%多聚甲醛溶液中固定24 h。

1.4.2 HE染色：取固定好的胃組織，流水沖洗去除甲醛，依次放入濃度梯度乙醇溶液中脫水，二甲苯透明，取干凈石蠟融化后包埋組織，采用切片機進行切片，切片厚度為4 μm。取切片，常規二甲苯脫蠟，依次放入降濃度梯度乙醇溶液中復水，水化完成后蘇木精染色15 min，流水沖洗數秒，鹽酸乙醇溶液處理，水洗后采用伊紅染色，流水沖洗后鏡檢，見染色滿意后經脫水、透明后完成封片，顯微鏡下觀察形態學變化。

1.4.3 免疫組化檢測微MVD：取石蠟切片(同1.4.2)，常規二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，切片上滴加3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性，孵育10 min；PBS清洗后加入胎牛血清封閉，加入一抗(兔抗鼠CD34多克隆抗體，1∶500稀釋)冰箱孵育過夜，PBS水洗，加入EnVision兔抗山羊二抗室溫孵育10 min，PBS沖洗切片，加入DAB溶液進行染色，鏡檢觀察顯色情況，顯色完畢后加入PBS終止顯色，經蘇木精復染、自來水沖洗反藍、脫水、透明后封片。MVD觀察：在低倍鏡視野下觀察整個黏膜組織切片，選擇微血管最密集的區域，在高背景下選取3個不重復視野進行計數，取平均數作為該標本MVD值；CD34陽性細胞定位于血管內皮細胞，黏膜內孤立棕黃色或棕褐色內皮細胞或內皮細胞簇即為1個血管。

1.4.4 蛋白印記雜交檢測COX-2、IL-1β 蛋白表達：取液氮凍存的黏膜組織提取蛋白，BCA法檢測蛋白濃度并進行稀釋備用，按照配方配置分離膠與濃縮膠，取50 μg蛋白與上樣緩沖液混合，煮沸3 min變性處理，以每條泳道8080 μl上樣，先以60 V電壓電泳，染料進入分離層后電壓調至90 V，電泳結束后轉膜1 h，轉膜結束后以5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗(兔抗人COX-2抗體、兔抗人IL-1β抗體)，4℃孵育過夜，TBS洗滌后加入二抗(辣根過氧化物酶標記抗鼠IgG抗體)，室溫孵育30 min，與ECL發光液等比例混合，室溫孵育3 min，采用去離子水浸泡，在凝膠成像系統下進行曝光并成像，采用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度值測定。

2 結果

2.1 3組小鼠體重變化情況 3組小鼠各時間點體重比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組小鼠體重變化情況

2.2 3組小鼠胃部病變發生情況比較 對照組小鼠試驗前及試驗后解剖可見胃黏膜形態光滑，未見腫瘤，未見黏膜出血、潰瘍、水腫等病理表現；模型組小鼠試驗結束后解剖，可見胃內腫物形成，伴有胃黏膜出血、糜爛；實驗組小鼠試驗結束后解剖，可見胃內腫物形成，與模型組小鼠比較，腫物體積較小。對照組小鼠未見腫瘤發生，模型組小鼠胃腫瘤發生率為70.0%(14/20)，干預組小鼠胃腫瘤發生率為40.0%(8/20)。見圖1。

A B

2.3 3組小鼠胃黏膜HE染色情況 HE染色顯示，模型組及干預組小鼠均可見慢性炎癥，淋巴濾泡形成及增生性病變(黑箭所示)。見圖2。

A B C

2.4 3組小鼠胃黏膜微血管情況 3組小鼠胃黏膜MVD比較差異有統計學意義(P<0.05)，模型組顯著高于對照組及干預組，干預組顯著低于模型組(P<0.05)。見圖3，表2。

A B C

表2 3組小鼠MVD表達 個

2.5 3組小鼠胃黏膜COX-2、IL-1β表達情況 與對照組小鼠比較，模型組小鼠胃黏膜COX-2、IL-1β表達升高，干預組小鼠胃黏膜COX-2、IL-1β表達顯著低于模型組(P<0.05)。見圖4，表3。

圖4 3組小鼠胃黏膜COX-2、IL-1β表達情況

表3 3組小鼠腫瘤直徑、MVD及COX-2、 IL-1β表達

3 討論

目前認為，幽門螺旋桿菌感染、胃黏膜炎癥是導致上皮化生、胃癌發生的重要因素，炎癥在其中發揮重要作用[5,6]。甘草是臨床常用的中藥材，18β-甘草次酸是重要的活性成分。體外研究表明，18β-甘草次酸對多種腫瘤細胞有一定抑制作用[7,8]。

本研究構建K19-C2mE轉基因小鼠模型，這一模型與既往使用化學藥物刺激、幽門螺旋桿菌感染等胃癌模型不同，其成癌效果有保證，且其成癌過程與人類自然形成的胃癌有較高的相似度[9]。本研究結果顯示，模型組小鼠飼養52周后盡管體質量無明顯改變，但解剖可見胃內腫物及胃黏膜充血、水腫等現象，提示模型組小鼠建模較為成功。給予18β-甘草次酸飲水的小鼠胃內腫物直徑較小，推測18β-甘草次酸有一定抑制腫瘤生成及生長的效應，這一結果與既往尤麗麗等[10]研究結果類似。

腫瘤的無侵襲性生長方式是判斷是否為惡性腫瘤的重要特征，這一變化與黏膜組織中血管生成密切相關，新生血管為腫瘤細胞提供營養，也會以旁分泌方式刺激腫瘤的生長[11]。既往有動物研究顯示，采用化學致癌劑誘發的胃癌癌前病變及胃癌模型小鼠的胃黏膜均存在血管異常豐富的情況，腫瘤間質也發現有血管生成[12]。本研究采用免疫組化方法分析3組小鼠微血管形成情況，結果顯示模型組小鼠微血管密度顯著高于對照組小鼠，而給予18β-甘草次酸的小鼠微血管密度低于模型組，提示18β-甘草次酸可抑制黏膜微血管的生成。

為進一步探討腫瘤發生發展過程中的炎性指標水平變化，本研究對黏膜組織內COX-2及IL-1β表達情況進行檢測，COX-2是花生四烯酸轉化成前列腺素代謝過程中的限速酶，不僅是啟動炎性反應的關鍵酶，也與新生血管生成密切相關[13,14]。既往關于胃癌的臨床研究發現，胃癌組織內存在COX-2表達的明顯升高，且其表達水平與腫瘤組織MVD相關[15]。IL-1β是一種在腫瘤發生及發展過程中發揮重要作用的炎性因子，一方面能通過調控其他炎性因子表達介導炎性反應，另一方面也能調節機體免疫功能，參與腫瘤細胞逃逸過程[16]。

本研究結果顯示，模型組小鼠黏膜中COX-2、IL-1β表達水平明顯升高，這一結果與既往報道的惡性腫瘤組織內蛋白表達量升高[17,18]類似，給予18β-甘草次酸的小鼠COX-2、IL-1β表達低于模型組，提示18β-甘草次酸可抑制炎性因子及代謝相關酶類，降低黏膜炎癥、降低新生血管生成，從而達到抑制腫瘤生成及生長的效果。筆者發現既往關于18β-甘草次酸抑制胃癌腫瘤生長的研究不多，結合18β-甘草次酸的藥理學研究，抗炎是18β-甘草次酸最重要的藥理作用，已有的研究表明，18β-甘草次酸可通過選擇性抑制與磷脂酶A2及脂加氧酶活性，降低白三烯、前列腺素E2等炎性介質的產生[19]，抗炎效應可直接減輕胃黏膜的炎癥，降低潰瘍、糜爛、水腫等炎癥病變的反復發生，達到抑制胃癌的目的。

綜上所述，18β-甘草次酸可降低K19-C2mE自發胃腫瘤轉基因鼠胃腫瘤發生率，減輕黏膜炎性反應，抑制新生血管生成，其機制可能與下調COX-2、IL-1β等因子表達水平有關。