正交試驗優選麝香化瘀醒腦顆粒水提工藝*

黃 江，黃 銳，袁 淵，蒲清榮，楊思進，白 雪，楊云芳

（西南醫科大學附屬中醫醫院，四川 瀘州 646000）

麝香化瘀醒腦方是我院國家臨床重點專科中醫腦病團隊治療出血性中風病的臨床經驗方。該方由麝香、黃芪、三七、生大黃、桂枝、大血藤、澤瀉等藥材制成，有風藥開竅、活血利水功效，治療出血性中風病急性期療效較好，且安全可靠［1-5］。為方便患者服用與攜帶，我院擬將其研制成中藥顆粒劑。為充分發揮方中藥物活性成分功效，根據該制劑處方中各藥材相關的化學成分與藥理作用，對方中君藥麝香、臣藥三七（打粉）直接入藥，其余藥材以水為溶劑進行煎煮提取；以具有瀉下利濕、逐瘀通經功效，且與該方功效基本一致的其余藥材（除上述2 味藥材）中總蒽醌含量和干浸膏質量作為綜合評價指標［5-8］，采用L9（34）正交試驗法優選該制劑的水提工藝參數，為其制備提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 20AT 型高效液相色譜儀、AUW120D 型電子天平（日本Shimadzu 公司）；QP - 01 型真空泵（天津奧特賽恩儀器有限公司）；JPGT0328型全數字超聲波發生器（武漢嘉鵬電子有限公司）；NRB17S3W 型電冰箱（日本Panasonic公司）；HH 數顯電熱恒溫水浴箱（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）；ZK072型電熱真空干燥箱（上海實驗儀器廠）。

1.2 試藥

大黃素對照品、大黃酚對照品、大黃酸對照品、大黃素甲醚對照品、蘆薈大黃素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110756 - 200110，110796 -201520，110757 - 201607，110758 - 201415，110795 -201710，含 量 分 別 為96%，99.4%，99.3%，99.2%，98.3%）；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。麝香、黃芪、三七、大黃、桂枝、大血藤、澤瀉藥材飲片（瀘州寶光醫藥有限公司，批號分別為19052001，191202，191102，190701，200101，190402，191001）。

2 方法與結果

2.1 干浸膏質量測定

按麝香化瘀醒腦方處方比例稱取黃芪、生大黃、桂枝、大血藤、澤瀉等5 味中藥材飲片9 份，提取，濾過、濃縮，加甲酸定容至500 mL（相當于原藥材46 g）。精密量取提取液50 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴濃縮至膏狀，105 ℃干燥至恒重，置干燥器中30 min，迅速精密稱定質量，計算干浸膏質量（g）［9］。

2.2 總蒽醌含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：UltimateTMC18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇- 0.1%磷酸水溶液（85∶15，V/V）；流速：1 mL/ min；檢測波長：254 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：10μL。

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：稱取大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素對照品各適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1mL 含大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素各80μg，大黃素甲醚40μg 的單一對照品溶液，各精密量取2 mL，混勻，即得混合對照品溶液。

供試品溶液：取2.1 項下提取液適量，以甲醇定容至500 mL，濾過。精密吸取續濾液5 mL置燒瓶中，水浴揮干，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲（功率350 W，頻率35 kHz；下同）處理2 min，加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉移至10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：稱取處方量麝香化瘀醒腦顆粒陰性樣品（不含大黃），按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各10μL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定。結果供試品溶液在與對照品溶液相同保留時間處有相應色譜峰，且陰性對照無干擾，理論板數按大黃素峰計應不低于3 000［10］，專屬性良好，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Aloe emodin 2.Rhein 3.Emodin 4.Chrysophanol 5.Emodin methyl ether A.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密吸取2.2.2項下混合對照品溶液1，4，8，12，16，32μL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的回歸方程分別為Y1=4 991.2X1- 35.6（R2= 0.999 8）、Y2= 3 476.4X2-37.3（R2= 0.999 7）、Y3= 5 610.2X3- 22.4（R2=0.999 9）、Y4= 4 079.3X4- 33.7（R2= 0.999 9）、Y5=869.4X5-69.5（R2=0.999 8）。結果表明，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚進樣量均在0.016 ～0.512μg范圍內，大黃素甲醚在0.008 ～0.256 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取混合對照品溶液適量，按2.2.1項下色譜條件連續進樣測定5次，記錄峰面積。結果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.15%，1.25%，1.33%，1.27%，0.66%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12 h時按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.01%，0.59%，1.09%，1.46%，1.29%（n=6），表明供試品溶液室溫下放置12 h內基本穩定。

重復性試驗：取同一提取液6 份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定。結果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.35%，1.51%，1.53%，1.36%，1.25%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：稱取已知含量的樣品9 份，每份約5 g，精密稱定，分別按其中所含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的50%，100%，150%，加入各單一對照品溶液，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

耐用性試驗：取同一供試品溶液適量，分別在色譜條件一定波動范圍［流速（0.8± 0.2）mL/min，檢測波長（254±2）nm，柱溫（40±5）℃］內進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的RSD分別為0.73%，0.65%，1.01%，1.12%，1.05%，表明該色譜條件小范圍變化時本方法能滿足試驗要求，耐用性良好。

2.3 正交試驗優選水提工藝

根據處方中各藥物性質，麝香、三七（打粉）直接入藥，其余藥物采用傳統的水煎煮法提取。以加水量（因素A）、浸泡時間（因素B）、提取時間（因素C）、提取次數（因素D）為考察因素，以干浸膏質量與總蒽醌含量的綜合評分為評價指標，優選最佳水提工藝參數。綜合評分=［（干浸膏質量/干浸膏質量最大值）× 0.5 +（總蒽醌含量/總蒽醌含量最大值）×0.5］×100［11-12］。因素與水平見表2，正交試驗設計與結果見表3，方差分析結果見表4。

表2 因素與水平Tab.2 Factors and their levels

由表3可知，各因素對水提工藝綜合評分的影響順序為D ＞A ＞C ＞B，最佳工藝組合為A3B1C3D2。由表4可知，各因素對結果均有顯著影響。綜合考慮提高生產效率與節約能耗等因素，最終優化提取工藝為A2B1C1D2，即加10倍量水，浸泡0.5 h，煎煮2次，每次1.0 h。

表3 L9（34）正交試驗設計與結果Tab.3 Deign and results of the L9（34）orthogonal test

表4 方差分析結果Tab.4 Results of the ANOVA

2.4 驗證試驗

按選定的最佳工藝進行3 次提取試驗，結果穩定。詳見表5。

表5 驗證試驗結果Tab.5 Results of the validation test

3 討論

本研究中根據麝香化瘀醒腦方中各藥材藥理活性特點等信息，同時考慮我院制劑生產特點，將方中麝香、三七（打粉）直接入藥，黃芪、大黃等5味藥材進行水提。以提取液作為黏合劑，以糊精為輔料，加入三七粉、麝香，采用濕法制粒法制粒，干燥、整粒即得麝香化瘀醒腦顆粒［11-12］。提取工藝為藥物制劑的關鍵因素，因此本研究中采用正交試驗研究麝香化瘀醒腦顆粒的提取工藝，綜合比較各因素對提取效果的影響程度，并研究各因素的主次及相互作用，從而確定最優提取工藝條件［13］。

麝香化瘀醒腦顆粒中，大黃具有瀉下利濕、逐瘀通經功效，與麝香化瘀醒腦顆粒組方原理基本一致，故筆者根據預試驗結果，選擇大黃有效成分總蒽醌含量及干浸膏質量各占50%權重的綜合評價指標［14-15］控制質量，采用正交試驗設計優選麝香化瘀醒腦顆粒水提工藝參數，并經驗證其參數穩定、可靠。測定大黃總蒽醌含量的高效液相色譜（HPLC）法及色譜條件參考了2020 年版《中國藥典（一部）》中大黃藥材項下相關內容，結果分離效果好且峰形不拖尾，能較好地將5 種蒽醌類物質分離。綜上所述，本研究中優化的工藝操作簡便，結果穩定，可用于麝香化瘀醒腦顆粒的水提。建立的HPLC法快速，靈敏度、準確度高，可為麝香化瘀醒腦顆粒生產過程中的質量控制及其后續質量標準研究提供參考。