西瓜蔓枯病菌的分離與鑒定及種質資源抗性評價

徐楚臻，劉金鑫，王喜慶，閆 聞，付永凱，李永剛

（1.東北農業大學植物保護學院 哈爾濱 150030；2.黑龍江省農業科學院園藝分院 哈爾濱 150069）

西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum.]是葫蘆科西瓜屬植物，也被稱為夏瓜、寒瓜等，原產于非洲，自西域傳入中國[1]。西瓜是世界上重要的園藝經濟作物，而中國是世界上第一大西瓜生產國，占全球總產量的70%左右[2]。近年來，我國種植業不斷發展，西瓜栽培面積日漸擴大，尤其是隨著設施瓜類栽培技術的逐漸推廣，導致許多瓜類病蟲害的大范圍流行，降低了西瓜的品質和產量[3]。西瓜蔓枯病（Gummy stem blight）是一種真菌性土傳病害，發生范圍廣，且在整個生育期均可發病，可危害葉片、莖蔓和果實，其中莖蔓受害最為嚴重。據報道，西瓜蔓枯病發病率一般為15%～25%，嚴重時在60%～80%，病害流行時可使瓜田減產15%～30%，嚴重時可達80%，對西瓜的產量和品質以及我國的瓜類產業發展造成極大影響[4-6]。

國際上多認為蔓枯病菌有性態為Didymellabryoniae，無 性 態 為Stagonosporopsis cucurbitacearum[7]，也有學者認為在大多蔓枯病菌寄主植物上可同時發現無性孢子與有性子實體，所以劃分有性型和無性型意義不大[3]。2015 年，Stewart 等[7]明確，亞隔孢殼屬病菌由S.cucurbitacearum、S.caricae和S.citrulli3 個親緣關系相近的種組成，其中危害最廣的病原菌為S.cucurbitacearum。如今國際使用Stagonosporopsisspp.作為蔓枯病菌的學術名稱[8-9]。當病原菌侵染幼苗的莖部時，起初呈水漬狀斑，迅速向上、下擴展，隨后病斑可環繞莖部，迅速導致幼苗死亡。成株多于莖基部與節間發病，初期呈水浸狀灰綠色病斑，形狀多為棱形、橢圓及條形，后發展成黃白色凹陷病斑，病部龜裂，有時可見分泌形成的黃褐色膠狀物。后期病斑表面散生黑色小顆粒，環境濕度高時，病部腐爛，維管束外露，呈現麻絲狀[10-11]。

目前，瓜類蔓枯病的防治仍以化學防治為主，但該病害一般于中后期發病較重，西瓜是直接入口食物，化學殺菌劑的使用會對環境和人體健康造成較大危害，同時也極易導致病原菌產生抗藥性。因此，選育抗病品種是防治瓜類蔓枯病最經濟有效且安全的方法，而抗病種質資源的篩選與鑒定是抗病育種工作的基礎。中國抗蔓枯病西瓜品種相對數量較少[3]。筆者對黑龍江省西瓜蔓枯病菌進行了分離與鑒定，并對31 份西瓜種質材料接種蔓枯病以鑒定其抗性，以期篩選出較為優良的資源，為西瓜蔓枯病的抗病育種提供資源、技術方法及理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試西瓜品種 供試31 份西瓜種質資源以及致病性測定試驗中所選用的西瓜品種龍盛佳星，其中，WG-12、WG-16 和WG-31 為中果型，其他種質為大果型，31 份西瓜種質均由黑龍江省農業科學院園藝分院國家西甜瓜產業技術體系哈爾濱試驗站提供。

1.1.2 供試病原菌 于2022 年7－8 月從黑龍江省農業科學院園藝分院試驗地發病嚴重的地塊采集癥狀典型的西瓜蔓枯病病樣。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與鑒定 采用組織分離法[12]，于病健交界處切取組織塊，依次用70%乙醇消毒30 s、1.5%次氯酸鈉處理5 min，無菌水漂洗3 次后置于無菌濾紙吸干水分。隨后將組織塊擺放于加入50 μg?mL-1鏈霉素的PDA 培養基平板上，26 ℃培養2～3 d 后挑取邊緣菌絲進行純化，使用純化后的菌株進行單孢分離，將所獲菌株轉移至試管斜面培養，于4 ℃保存備用。通過觀察菌落形態和孢子形態特征等方式對獲得的單孢株進行初步鑒定。

為了進一步明確病原菌的種類，將所有單孢株于PDA 平板上培養5 d，刮取適量病原菌菌絲，利用真菌基因組DNA 提取試劑盒（上海生工有限公司）提取DNA，采用通用引物細胞核核糖體DNA 內轉錄間隔區（internal transcribed space，ITS）進行擴增，引物序列見表1。使用PCR 擴增儀（GeneAmpPCRSystem9700）進行擴增，擴增體系（50 μL）為：2×TaqMaster Mix 25 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 19 μL。反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30 個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物由上海生工有限公司進行純化及測序，使用Blast 對測序結果進行同源性比對，使用MEGA 7.0 通過Neighbor-joining 法構建ITS 基因的系統發育樹，校驗參數設置為Bootstrap1000 次重復[13]。

表1 所用引物序列

1.2.2 病原菌的致病性測定 遵循柯赫氏法則[14]進行致病性測定，參照Li 等[15]的方法，將單孢株在25 ℃培養7 d，誘導S.cucurbitacearum產生分生孢子并將其刮到無菌水中，經3 層滅菌紗布過濾，通過血球計數板將濾液稀釋為1×106個孢子·mL-1的菌懸液，備用。

選取健康且生長一致的西瓜幼苗（3 片真葉期），采用孢子懸浮液噴霧法接種幼苗至植株飽和狀態，對照組用無菌水代替。接種后置于溫室（23±3）℃用塑料布保濕培養，每個處理15 株幼苗，3 次重復，采用完全隨機區組的試驗設計。接種后觀察發病情況，待植株發病充分且相對穩定后進行調查，參照張學軍等[16]的病害分級標準，并稍作調整。分級如下：0 級，無病斑；1 級，零星的小病斑；3 級，連續的小病斑或大病斑（沒有繞莖）；5 級，大病斑（繞莖）；7 級，莖部失水萎縮但植株并未死亡；9 級，莖部失水萎縮且全株死亡。

病情指數=Σ（各級病株數×各級代表值）/（調査總株數×最高級代表值）×100。

致病力評價指標：強致病力菌株（S），病情指數>60；中等致病力菌株（M），50<病情指數≤60；弱致病力菌株（W），病情指數≤50。

1.2.3 西瓜種質資源的蔓枯病抗性評價 選取31份西瓜育種資源，在溫室內利用育苗缽（8 cm×8 cm×5 cm）培養至3 片真葉期，選用1.2.2 中致病力最強的菌株作為接種的目標病原菌，依據1.2.2的方法配制孢子懸浮液，采用噴霧接種法對31 種不同的種質資源進行病原菌接種，對照組采用無菌水代替孢子懸浮液。接種后置于溫室（23±3）℃用塑料布保濕培養，每個處理15 株幼苗，3 次重復，采用完全隨機區組的試驗設計。待植株充分發病且相對穩定后調查，病害分級標準同上。

以病情指數作為評價依據，將不同品種劃分為6 個抗性等級[17]，分別為：免疫（IM），DI=0；高抗（HR），080。

1.3 數據分析

采用SPSS 26.0 軟件，通過Duncan 法對試驗數據進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 西瓜蔓枯病菌的分離與鑒定

2022 年7－8 月在黑龍江省農業科學院園藝分院西瓜試驗地中發現較多莖蔓上疑似蔓枯病癥狀的西瓜植株（圖1）。采用組織分離法，從16 個西瓜植株上分離得到16 株形態學一致的真菌分離物，菌落正面呈灰白色，邊緣稀疏中間稠密，老化后出現不同層次的同心輪紋，菌落背面可見墨綠色輪圈，打開培養皿時可聞到“灰土味”（圖2）。分生孢子呈圓柱形或橢圓形，大小為（2.45～8.02）μm×（1.35～3.60）μm，大部分無隔膜，少數單隔膜（圖3-A，箭頭1）和雙隔膜（圖3-A，箭頭2）。依據形態學初步鑒定16 株分離物為S.cucurbitacearum。

圖1 西瓜蔓枯病田間發病癥狀

圖2 16 株來自西瓜莖部真菌分離物的菌落形態

選取代表性菌株XG2，提取DNA，對內轉錄間隔區（ITS）進行PCR 擴增，所得片段大小為535 bp。將序列上傳 Genebank 數據庫，登錄號為OP930948，利用Blast 進行同源性比較，顯示菌株XG2 與S.cucurbitacearumS2-5（MZ057819.1，ITS）的同源性為99.80%。使用MEGA 7.0 軟件進行系統發育樹的構建，結果如圖3-B 所示，XG2 與S.cucurbitacearumR-J10（GU045303.1）、S.cucurbitacearumLHG-8（KM216012.1）、S.cucurbitacearumS2- 5（MZ057819.1）、S.cucurbitacearumZE（HQ914649.1）的親緣關系接近，相似性達99.00%，屬于同一進化枝，同為S.cucurbitacearum。

圖3 來自西瓜莖部真菌分離物代表性菌株XG2 的分生孢子及系統發育樹

基于形態學、分子生物學鑒定和系統發育樹分析，結果表明，分離得到的代表性菌株XG2 為力強弱分為3 個等級。由表2 可以看出，菌株XG2、XG8、XG26、XG28 為強致病力菌株（S），4 個強致病力菌株的病情指數間均存在顯著差異，其中XG2 致病力最強，為96.00%；XG29、XG9、XG1、XG5、XG30、XG10、XG7、XG15 為中等致病力菌株（M），其中XG29 致病力最強，且病情指數僅與XG9、XG1 無顯著差異，與其他5 個菌株均存在顯著差異；XG11、XG21、XG12、XG13 為弱致病力菌S.cucurbitacearum。

表2 16 株西瓜蔓枯病菌的致病力測定

2.2 分離物的致病力測定

將得到的16 株真菌分離株，采用噴霧法接種至3 片真葉的西瓜幼苗上，發病幼苗均顯示出與田間發病株相同的癥狀，且從病斑上均能再次分離純化出相同的真菌分離物，根據柯赫氏法則明確了16株真菌分離物均為西瓜蔓枯病菌。依據病情指數分級標準（圖4）進行調查，將真菌分離物按照致病株（W），其中XG13 致病力最弱，病情指數為37.33%，與其他3 個菌株間存在顯著差異。

圖4 西瓜蔓枯病病情指數分級標準

2.3 31份西瓜種質資源的蔓枯病抗性評價

由表3 可以看出，31 份西瓜種質資源對西瓜蔓枯病菌的抗性表現為高感（HS）至抗病（R）水平。抗病 材 料 有5 份（16.13%）：PI 189225、WG-15、WG-27、PI 482307、WG-7，其中PI 189225 的抗性最強，病情指數為39.26，5 份抗病材料間病情指數無顯著差異；中抗材料有6 份（19.35%）：PI 271775、WG-31、龍盛619、WG-23、WG-20、雷首，其中PI 271775 抗性為中抗材料中最強，病情指數為51.11，且與WG-31、龍盛619 間差異不顯著，但與WG-23、WG-20、雷首間差異顯著；感病材料有10份（32.26%）：WG-8、Calhoun Gray、WG-4、WG-14、WG-1、中野2 號、WG-12、WG-21、WG-3、W22-59，其中感病最弱的材料為WG-8，病情指數為64.44，與其他9 份材料間均存在顯著差異；高感材料有10份（32.26%）：PI 299379、PI 635712、WG-6、WG-30、WG-22、WG-29、WG-26、WG-16、WG-28、WG-24，其中WG-24 病情指數為97.04，感病性最強，與同級別材料中WG-28 差異不顯著，與其他8 份材料均差異顯著。

表3 31 份西瓜種質資源抗蔓枯病菌的評價

3 討論與結論

蔓枯病菌是危害葫蘆科作物的重要真菌病原物，主要危害西瓜、甜瓜、黃瓜、苦瓜、絲瓜等作物。近年來隨著氣候條件的改變，蔓枯病在全國范圍內迅速流行起來，發病速度之快導致該病害極難防治，嚴重影響了我國乃至世界的瓜類產業。西瓜蔓枯病的致病菌為S.cucurbitacearum、S.citrulli和S.caricae3 種[18]，因形態學特征相似，難以將它們區分，所以需要借助分子生物學方法來準確鑒定蔓枯致病菌[7-8]。因此，筆者采用真菌鑒定通用引物ITS，結合形態學特征及系統發育樹分析最終確定分離得到的西瓜蔓枯病致病菌均為S.cucurbitacearum。

西瓜蔓枯病是世界范圍內西瓜栽培中發生最為嚴重的病害之一，解決該病害最安全、經濟有效的途徑是選育并栽培抗病品種，抗性評價是抗性種質資源篩選以及創新工作中的關鍵一環。我國西瓜種植區域廣，且各地區氣候差異極大，而環境條件突變可導致西瓜品種抗病性的喪失，因此選育適宜在當地栽培種植且綜合性狀優良的抗蔓枯病品種仍是今后的研究重點與難題[9,19]。

針對西瓜種質資源抗蔓枯病的評價工作開展得較少，徐彥剛等[2]對不同地域來源的80 份西瓜種質資源進行抗亞隔孢殼菌（S.citrulli）鑒定，沒有發現免疫資源，篩選到高抗材料2 份，抗性材料19份，中抗材料21 份，感病材料24 份，高感材料14份，抗性材料的占比達到33.34%。宋榮浩等[20]對收集引進的42 份西瓜品種資源進行了大田成株期及室內苗期蔓枯病抗性的人工接種鑒定，沒有發現免疫和高抗品種，篩選出了8 個蔓枯病抗性較強同時兼具優良農藝性狀的品種材料。

總的說來，西瓜種質資源缺乏對蔓枯病免疫和高抗的材料，但存在一定數量的中等抗性資源。通過對這些資源的抗性評價，為下一步抗病品種的培育及抗病機制的研究等提供了良好的材料和理論依據。筆者選取黑龍江地區分離得到的強致病力菌株XG2 作為接種真菌，對供試種質資源進行西瓜蔓枯病的抗性評價。從31 份西瓜種質資源中篩選到5 份抗病材料和6 份中抗材料，10 份感病材料和10 份高感病材料，抗病與中抗材料的總占比為35.48%，其中抗性最強的西瓜材料為PI 189225。