辣椒炭疽病菌Colletotrichum nigrum 鑒定、生物學特性及藥劑敏感性研究

陳鵬宇，楊立輝，翟長蘭，田慧迪，張 敏，白慶榮，2，趙廷昌

（1.吉林農業大學植物保護學院 長春 130118；2.綠色農藥全國重點實驗室·綠色農藥與農業生物工程教育部重點實驗室·貴州大學精細化工研究開發中心·貴州大學 貴陽 550025；3.中國農業科學院植物保護研究所 北京 100193）

辣椒炭疽病是由炭疽菌屬（Colletotrichumspp.）真菌引起的一種常見病害，可導致幼苗死亡、葉片和果實腐爛，發病嚴重時，病果率在30%～40%[1]，嚴重影響辣椒的產量和品質。炭疽菌屬（Colletotrichum）真菌是世界上重要的植物病原真菌群[2]，無性態為無性態真菌（Anamorphic fungi）炭疽屬（Colletotrichum），有性態為子囊菌門（Ascomycota）小叢殼屬（Glomerella）[3]。

在辣椒炭疽菌的早期分類中，根據病害癥狀分為紅色炭疽病菌、黑色炭疽病菌和黑點炭疽病菌[4]。目前在我國天津、四川、貴州、廣東、甘肅、陜西等地均有辣椒炭疽病的報道，引起辣椒炭疽病的病原菌主要包括C.acutatum（尖孢炭疽菌）、C.truncatum（平頭炭疽菌）、C.spinaciae（菠菜炭疽菌）、C.boninense（博寧炭疽菌）、C.gloeosporioides（膠孢炭疽菌）、C.siamense（暹羅炭疽菌）、C.fructicola（果生炭疽菌）、C.scovillei（斯高維爾炭疽菌）、C.karstii（喀斯特炭疽菌）[5-11]。

2021 年辣椒炭疽病在吉林省多地和內蒙古自治區東部地區的辣椒主產區大面積發生，對辣椒產業造成了十分嚴重的危害。筆者所在團隊于2021年在吉林省洮南市、雙遼市、長春市農安縣、松原市長嶺縣和內蒙古自治區通遼市開魯縣的辣椒主產區進行辣椒炭疽病病樣的采集，對病樣進行分離純化，明確病原菌分類地位，并對主要病原菌生物學特性及藥劑敏感性進行研究，以期為辣椒炭疽病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

2021 年9—10 月對吉林省及內蒙古自治區東部地區的辣椒主產區進行辣椒病樣采集，記錄發病特征并拍照，標本保存于吉林農業大學植物保護學院植物病理學教研室。分離物致病性測定供試菌株：在不同地區分離菌株中隨機挑選1 株，分別為HS4Y- 2- 19、DSD2Y- 1- 41、QTXB2Y- 2- 5- 1、QJB1-2-36、HJ1Y-2-50、HLHY9-1-4-1。分子生物學測序供試菌株：在不同采樣點分離菌株中隨機選取以下菌株，分別為HS4Y-2-19、DSD2Y-1-41、MX6-1-45、QTN2Y-2-4-2、QTXB2Y-2-5-1、HLHY9-1-4-1、BPY1-3-49、HJY3-1-55、BPY3-2-60、QTN1Y-1-35、HJY1-2-50、QJB1-2-36。生物學特性及室內藥劑敏感性供試菌株為HS4Y-2-19。選用25 種化學殺菌劑作為供試藥劑，藥劑名稱及生產廠家見表1。供試試劑有β-巰基乙醇、乙二胺四乙酸（EDTA）、無水乙醇、75%乙醇、瓊脂糖、Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒（生工生物工程上海股份有限公司）。

表1 供試藥劑

供試培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（Potato Dextrose Agar，PDA）、燕麥瓊脂培養基（Oatmeal Agar，OA）、水瓊脂培養基（Water Agar，WA）、西紅柿燕麥瓊脂培養基（Tomato Oatmeal Agar，TOA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基（Potato Sucrose Agar，PSA）、胡蘿卜瓊脂培養基（Carrot Agar，CA）、玉米粉瓊脂培養基（Corn Meal Agar，CMA）、V8 碳酸鈣瓊脂培養基（V8 Agar，V8）、查氏培養基（Czapek-Dox Agar，Czapek）。

供試儀器為光學顯微鏡（ZEISS ImagerA.2）、超景深顯微鏡（VHX-600）、GI80DWS 高壓蒸汽滅菌鍋（上海言和）、SW-CJ-2D 型雙人凈化工作臺（浙江蘇凈凈化）、BIC-300 人工氣候培養箱（上海博訊）、DHG-9140A 電熱恒溫鼓風干燥箱（上海申賢恒溫設備廠）、BCD-217CHG 立式冷藏柜（河南新飛電器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 辣椒炭疽病病原菌的分離純化 2021 年9—11 月，將采集到的辣椒炭疽病標本用無菌水清洗并消毒后，用滅菌剪刀剪取病健交界處的組織塊5 mm×5 mm，組織塊經體積分數為75%乙醇消毒，無菌水漂洗3 次，在無菌操作臺內將表面水分晾干后，放入事先準備好的PDA 平板中，在恒溫培養箱中25 ℃暗培養。待組織塊在PDA 平板上長出菌絲后，用滅菌牙簽在菌落邊緣挑取菌絲塊放在新的PDA 平板中，置于恒溫培養箱25 ℃暗培養。

1.2.2 分離物的致病性測定 2021 年11 月，采用菌絲侵染和孢子侵染2 種方式進行致病性測定。待分離物在PDA 培養基上長至直徑為培養皿2/3時，選取不同地區的代表菌株1 株，用打孔器制備直徑為6 mm 的菌餅備用，另用無菌水將孢子洗脫制備成濃度為1.0×106個·mL-1孢子懸液備用。用無菌水將新鮮辣椒果實（辣帝1 號，山東壽禾種業有限公司）表面沖洗干凈后，使用75%乙醇對其進行表面消毒并使用無菌接種針制造細微傷口，分別將制備好的菌餅貼在細微傷口處；孢子懸浮液涂抹在細微傷口處，以無菌水作為對照，于25 ℃恒溫培養箱中保濕培養，逐日觀察發病情況。

1.2.3 病原菌形態特征觀察 2021 年11 月，在PDA 培養基上觀察菌落生長狀況。用光學顯微鏡（ZEISS ImagerA.2）觀察分生孢子器和分生孢子的形態并拍照記錄，用超景深顯微鏡（VHX-600）測量孢子大小（測量100 個），初步確定病原菌的分類地位。

1.2.4 病原菌的分子生物學鑒定 2021 年11－12 月，在吉林農業大學經濟作物病害與生物防治研究室內進行病菌分子生物學鑒定。采用Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒提取不同地區的代表菌株基因組DNA（供試代表菌株信息見表2），選用ITS、ACT、TUB2、GAPDH和CHS-1進行PCR 擴增，各基因擴增所需引物見表3。

表2 供試代表菌株

表3 引物信息

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，25.0 μL 的反應體系為Taqmixture 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 模板1.0 μL 以及9.5 μL 的dd H2O，擴增程序見表4。

表4 PCR 擴增信息

PCR 產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到清晰且單一的條帶委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序并拼接。將所得序列在NCBI網 站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）上與Gen-Bank 中相關序列進行一致性比對分析，使用MAGEX軟件最大似然法中的ML 方法構建系統發育樹。

1.2.5 病原菌的生物學特性 2022 年1 月，對病原菌進行生物學特性的研究，具體內容如下：

（1）不同培養基對病菌生長的影響 將供試菌株HS4Y-2-19 制成直徑為6 mm 的菌餅放置在PDA、OA、WA、TOA、PSA、CA、CMA 和V8 培養基制成的平板中央，每個平板定量15 mL，25 ℃黑暗條件下恒溫培養，3 次重復，8 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑[12]。

（2）不同碳源對病菌生長的影響 以查氏培養基為基礎培養基，分別以等量的葡萄糖、可溶性淀粉、D-麥芽糖、D-果糖、木糖醇、D-甘露糖、山梨醇、D-甘露醇、乳糖代替蔗糖。每個平板定量15 mL 培養基，25 ℃黑暗條件下恒溫培養，3 次重復，8 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑。

（3）不同氮源對病菌生長的影響 以查氏培養基為基礎培養基，分別以等量的L-丙氨酸、L-賴氨酸、蛋白胨、甘氨酸、磷酸二氫銨、L-胱氨酸、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀、尿素替換硝酸鈉。每個平板定量15 mL 培養基，25 ℃黑暗條件下恒溫培養，3 次重復，8 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑。

（4）不同溫度對病菌生長的影響 以PDA培養基為基礎培養基，每個平板定量15 mL 培養基，分別置于4、10、15、20、25、30、35 ℃培養箱黑暗培養，3 次重復，8 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑。

（5）不同光照對病菌生長的影響 以PDA 培養基為基礎培養基，每個平板定量15 mL 培養基，分別置于25 ℃全光照、12 h 光照/12 h 黑暗、全黑暗條件下恒溫培養，3 次重復，8 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑。

（6）不同pH 值對病菌生長的影響 以PDA培養基為 基 礎 培 養 基，用HCl（1 mol?L-1）和NaOH（1 mol?L-1）調試培養基pH 值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 和11.0，每個平板定量15 mL培養基，25 ℃黑暗條件下恒溫培養，3 次重復，8 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.6 病菌對藥劑的敏感性測定 2022 年3 月，分別采用菌絲生長速率法和孢子萌發法測定病菌對藥劑的敏感性[13]。

（1）菌絲生長速率法 向50 mL 三角瓶中注入27 mL 的PDA 培養基，高壓蒸汽滅菌鍋滅菌。將不同殺菌劑稀釋為1×103mg·L-1、1×102mg·L-1、1×10 mg·L-1、1 mg·L-1、1×10-1mg·L-1、1×10-2mg·L-16個質量濃度，按照PDA 培養基、藥液的體積比為9∶1 制備成混藥平板，每個平板定量10 mL 混藥培養基，空白對照組以等量無菌水代替藥液，每個濃度設3 次重復。將供試菌株HS4Y-2-19 制成直徑為6 mm 的菌餅放置在混藥平板中央，置于25 ℃培養箱中黑暗條件下恒溫培養8 d 后，采用十字交叉法測量菌落直徑。

抑菌率/%=（對照組菌落直徑－處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑－菌餅原始直徑）×100。

計算出抑制率后，通過SPSS25 軟件計算不同藥劑對病原菌的抑制中濃度（EC50）并建立毒力回歸方程，得出相關系數。

（2）孢子萌發法 向50 mL 三角瓶中注入27 mL 的WA 培養基，高壓蒸汽滅菌鍋滅菌。不同殺菌劑的稀釋濃度如下：12%苯甲·氟酰胺SC 和10%苯醚甲環唑WG 質量濃度配置分別為1×104、5×103、2.5×103、1.67×103、1.25×103、1×103mg·L-1，其他殺菌劑配置質量濃度分別為1×103、1×102、10、1、1×10-1、1×10-2mg·L-1，按照WA 培養基、藥液的體積比為9∶1 制備成混藥平板，每個平板定量10 mL 混藥培養基，空白對照組以等量無菌水代替藥液。待病原菌在PDA 培養基上長至8 d 時，用無菌水洗平板制備成濃度為1.0×106個·mL-1孢子懸浮液。用移液器吸取100 μL 孢子懸浮液滴在不同濃度的混藥平板上并使用一次性涂布器將孢子懸浮液均勻涂布，置于25 ℃培養箱中黑暗條件下恒溫培養10 h 后，在顯微鏡下隨機觀察多個視野，記錄孢子萌發情況并計算抑制率，每個處理觀察100 個孢子以上。

孢子萌發率/%=（萌發孢子總數/孢子總數）×100；

孢子萌發抑制率/%=（對照孢子萌發率－處理孢子萌發率）/對照孢子萌發率×100。

計算出相對抑制率后，通過SPSS25 軟件計算不同藥劑對病原菌的抑制中濃度（EC50）并建立毒力回歸方程，得出相關系數。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離結果

將采集到的標本通過組織分離得到212 個菌株，見表5。

表5 病原菌信息統計

2.2 分離物致病性測定

辣椒炭疽病在田間侵染辣椒果實時產生橢圓形或不規則形病斑，初期表面稍凹陷，病斑中部黑色并產生黑色顆粒，邊緣黃色（圖1-A）。將供試菌株HS4Y- 2- 19、DSD2Y- 1- 41、QTXB2Y- 2- 5- 1、QJB1-2-36、HJY1-2-50、HLHY9-1-4-1 接種到新鮮的健康青尖椒果實上（辣帝1 號），以無菌水作為空白對照，接種3 d 后3 個接種點開始表現發病癥狀，接種7 d 后完全發病，產生黑色、中間處略凹陷、圓形、橢圓形或不規則形病斑，發病部位伴生黑色小顆粒（圖1-B、C），空白對照無發病跡象（圖1-D），接種發病的植株經再分離，獲得與接種菌株形態一致的分離物，證明接種用的分離物為該病害的病原菌。

圖1 辣椒炭疽病田間發病癥狀及致病性測定結果

2.3 辣椒炭疽病病原菌鑒定

2.3.1 病原菌形態學鑒定 將病原菌放置在PDA培養基上培養，置于25 ℃培養箱中黑暗條件下恒溫培養，初期菌落呈淡粉色（圖2），在菌落表面形成黑色微菌核和分生孢子盤，分生孢子盤著生剛毛，分生孢子橢圓形、單孢、無色、中間較兩端略窄，分生孢子大小為（11.84～23.41）μm×（2.29～8.47）μm，菌絲體附著孢灰黑色，形狀不規則，與C.nigrum形態特征一致。

圖2 菌株HS4Y-2-19 在PDA 培養基上的形態學特征

2.3.2 病原菌分子生物學鑒定 將供試菌株HS4Y-2-19 測序結果在GenBank 數據庫中進行BLAST 一致性比對，結果表明，該菌株的ITS、TUB2、ACT、CHS-1、GAPDH序列與GenBank 中C.nigrumCBS 132451 各序列（JX546846、JX546893、JX546654、JX546701、JX546750）的 一 致 性 均 為100%。

基于12 個供試菌株的ITS、TUB2、ACT、CHS-1和GAPDH的序列構建系統發育樹發現，供試菌株與炭疽菌屬C.nigrum的遺傳距離最近（圖3），支持率為99%且聚在同一分支，表明供試菌株均為C.nigrum。結合培養性狀和形態觀察，以及分子生物學鑒定結果，確定筆者在吉林及內蒙古東部地區辣椒炭疽病發病株上所分離純化的菌株為C.nigrum。

圖3 基于ITS、TUB2、ACT、GAPDH 和CHS-1 基因序列構建的系統發育樹

2.4 不同條件對病原菌菌絲生長的影響

2.4.1 不同培養基對病原菌菌絲生長的影響 供試菌株HS4Y-2-19 在8 種培養基上均可生長，在OA 培養基上菌絲生長速度最快，顯著大于在其他培養基上的菌絲生長速度；在CA 培養基上菌絲生長速度最慢，顯著小于其他培養基（圖4-A）。

2.4.2 不同碳源對病原菌菌絲生長的影響 供試菌株HS4Y-2-19 在不同碳源條件下均可生長，以D-麥芽糖為碳源的菌絲生長速度最快，與以淀粉為碳源的差異不顯著；以D-果糖為碳源的菌絲生長速度最慢，與以乳糖為碳源的差異不顯著（圖4-B）。

2.4.3 不同氮源對病原菌菌絲生長的影響 供試菌株HS4Y-2-19 在不同氮源條件下均可生長，在以蛋白胨為氮源的菌絲生長速度最快，顯著大于其他氮源的菌絲生長速度；在以L-胱氨酸為氮源的菌絲生長速度最慢，顯著小于其他氮源的菌絲生長速度（圖4-C）。

2.4.4 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響 供試菌株HS4Y-2-19 在不同溫度下菌絲生長速度存在一定差異，在20 ℃菌絲生長速度最快，顯著大于其他溫度條件下的菌絲生長速度，在4 ℃和35 ℃菌絲停止生長（圖4-D）。

2.4.5 不同光照對病原菌菌絲生長的影響 供試菌株HS4Y-2-19 在不同光照下菌絲都可以生長，在全黑暗條件下菌絲生長速度最快，與其他光照條件下菌絲生長速度相比差異不顯著（圖4-E）。

2.4.6 不同pH 值對病原菌菌絲生長的影響供試菌株HS4Y-2-19 在不同pH 值下均可生長，在pH 值為10 時菌絲生長速度最快，與pH值為9 時相比差異不顯著；在pH 值為7 時菌絲生長速度最慢，與pH 值為5 時相比差異不顯著（圖4-F）

2.5 病原菌對殺菌劑的敏感性測定結果

2.5.1 病原菌菌絲生長對藥劑的敏感性 由表6可知，代表菌株HS4Y-2-19 的菌絲生長對75%肟菌·戊唑醇WG、400 g·L-1氯氟醚·吡唑酯SC、240 g·L-1氯氟醚·吡唑酯EC、42.4%唑醚·氟酰胺SC、40%唑醚·戊唑醇SC、43%氟菌·肟菌酯SC、43%唑醚·氟酰胺SC 較為敏感，EC50＜1 mg·L-1；對40%苯醚甲環唑SC、430 g·L-1戊唑醇SC（拜耳）、430 g·L-1戊唑醇SC（寧波）、25%咪鮮胺EC、200 g·L-1氟酰羥·苯甲唑SC、50%腐霉利WP、250 g·L-1嘧菌酯SC、10%苯醚甲環唑WG 敏感性略低，1 mg·L-1＜EC50＜10 mg·L-1；對50%多菌靈WP、25%溴菌腈EC、25%溴菌腈WP、6%寡糖·鏈蛋白WP、70%甲基硫菌靈WP、12%苯甲·氟酰胺SC、22.5%啶氧菌脂SC、50%福美雙WP、4%四氟醚唑EW、50%異菌脲WP 的敏感性較低，EC50＞10 mg·L-1。

表6 代表菌株HS4Y-2-19 菌絲對25 種殺菌劑的敏感性

2.5.2 病原菌孢子萌發對藥劑的敏感性 由表7可知，代表菌株HS4Y-2-19 的孢子萌發對400 g?L-1氯氟醚·吡唑酯SC、50%福美雙WP、240 g?L-1氯氟醚·吡唑酯EC、250 g?L-1嘧菌酯SC、43%唑醚·氟酰胺SC、22.5%啶氧菌脂SC、40%唑醚·戊唑醇SC、25%溴菌腈EC、42.4%唑醚·氟酰胺SC、25%溴菌腈WP 的敏感性均較高，EC50＜1 mg·L-1；對50%多菌靈WP、25%咪鮮胺EC 敏感性略低，1 mg·L-1＜EC50＜10 mg·L-1；對43%氟菌·肟菌酯SC、75%肟菌·戊唑醇WG、50%腐霉利WP、70%甲基硫菌靈WP、200 g?L-1氟酰羥·苯甲唑SC、6%寡糖·鏈蛋白WP、430 g?L-1戊唑醇SC（拜耳）、4%四氟醚唑EW、10%苯醚甲環唑WG、12%苯甲·氟酰胺SC 的敏感性較低，EC50＞10 mg·L-1。40%苯醚甲環唑SC、50%異菌脲WP、430 g?L-1戊唑醇SC（寧波）效果不理想，在試驗最高質量濃度（1×103mg·L-1）下對孢子萌發無明顯抑制作用，未在表7 中列出。

表7 代表菌株HS4Y-2-19 孢子萌發對22 種殺菌劑的敏感性

3 討論與結論

C.nigrum由Halsted[14]首次于1891 年發現并命名，也有學者將其與C.gloeosporioides歸為一類，并認為在以辣椒為寄主時才被稱為C.nigrum[15]。在進行分子生物學鑒定過程中，發現其與C.coccodes的遺傳關系較近，據Liu 等[16]報道，C.nigrum和C.coccodes都可以侵染辣椒和番茄，但是只有C.coccodes可以侵染馬鈴薯。在貴州[17]、山東[18]均有C.nigrum侵染辣椒的報道，《中國真菌總匯》記載該病原菌在東北地區、內蒙古、陜西、江蘇、廣東、廣西、河南、河北等地均有侵染辣椒的記錄[19]。除此之外，該病原菌還可以侵染葫蘆[20]等作物。

馬榮群等[18]研究發現，最適合C.nigrum菌絲生長的碳源為麥芽糖，氮源為甘氨酸，pH 值為5～6，而筆者研究發現，最適碳源為D-麥芽糖，最適氮源為蛋白胨，最適pH 值為9～10。可能與病菌對辣椒品種及環境的適應性不同有關，有待于進一步研究確認。

筆者首次采用孢子萌發法測定C.nigrum孢子萌發對藥劑的敏感性，發現50%福美雙WP 對孢子萌發抑制作用較強（EC50為0.008 mg·L-1），但病原菌菌絲生長對50%福美雙WP 的敏感性較差（EC50為93.355 mg·L-1），因此可將該藥劑可用于預防C.nigrum侵染，這與李小霞等[17]的研究結果一致。C.nigrum菌絲生長對75%肟菌·戊唑醇WG 敏感性最高（EC50為0.021 mg·L-1），但其孢子萌發對該藥劑敏感性略低（EC50為35.039 mg·L-1），可用其進行發病后病害防治。在實際生產中，也要注意保護劑和治療劑使用的最佳時期，建議多種有效藥劑的輪換使用，以延緩抗藥性的發生。

通過對2021 年吉林省及內蒙古自治區東部地區的辣椒主產區辣椒炭疽病病樣的采集和病原菌的分離，并進行致病性測定，共計分離到212 株形態一致的病原菌，結合形態學特征和相關分子序列確定病原菌為Colletotrichum nigrum。病原菌的生物學特性研究發現，OA 培養基適合病原菌菌絲生長；D-麥芽糖是最佳碳源；蛋白胨為最佳氮源；最佳pH 為10；最適培養溫度為20 ℃；全黑暗時最適合菌絲生長。病原菌C.nigrum的菌絲生長和孢子萌發對藥劑敏感性測試結果表明，該菌對400 g?L-1氯氟醚·吡唑酯SC、240 g?L-1氯氟醚·吡唑酯EC、42.4%唑醚·氟酰胺SC、40%唑醚·戊唑醇SC、43%唑醚·氟酰胺SC 的敏感性均較高（EC50<1.0 mg·L-1），可作為該病害預防和治療的優選藥劑。