結直腸癌組織中miR-767-3p表達水平與上皮-間質轉化的關系分析

陳敏洋

結直腸癌（CRC）為具有高隱匿性、低長期生存率特點的常見惡性腫瘤，是全球癌癥相關性死亡的主要原因[1]。盡管腫瘤的診療技術在不斷發展，但CRC 的治愈率和長期生存率并沒有顯著的提高[2]。結直腸癌導致死亡的主要原因是遠處轉移，預計約60%的結直腸癌患者會出現轉移[3]。腫瘤轉移是一個高度復雜的多步驟過程，并且與上皮-間質轉化（EMT）密切相關[4]。而miRNA為動植物中廣泛存在的非編碼RNA[5]。目前許多研究發現，在各種疾病包括腫瘤的發生、發展、轉移中，各種miRNA 參與其中。有研究證實，CRC的miRNA 差異表達譜中miR-767-3p 明顯高表達，且具有一定的診斷價值[6]。而miR-767-3p 的表達是否參與癌細胞的浸潤和轉移有待探討，可通過研究癌細胞EMT 的程度分析。本研究通過觀察結直腸癌細胞和癌前細胞的miR-767-3p、EMT 相關蛋白表達情況及患者的病理特征，分析、推測結直腸癌組織中miR-767-3p 表達水平、EMT 及癌組織侵襲和轉移的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取江西省中西醫結合醫院病理科2017 年1 月-2021 年12 月收治的70 例結直腸癌患者的癌組織、癌旁正常組織石蠟標本及相關的臨床資料納入研究。男39 例，女31 例，年齡30～95 歲，平均（56.24±5.96）歲。其中結腸癌33 例，直腸癌37 例；TNM 分 期：Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ期分別4/29/22/15 例。診斷標準：參照文獻[7]《中國結直腸癌診療規范（2015 版）》中結腸癌或直腸癌的診斷標準。納入標準：符合上述標準且經病理學診斷確診為CRC；活檢前未經過放化療治療；根據影像手段、CRC 手術和病理組織可以明確腫瘤的癌體位置、浸潤深度及轉移情況。排除標準：合并其他腫瘤；嚴重肝腎功能損害。

1.2 方法 收集患者結直腸癌組織和癌旁正常組織包埋在石蠟中，冰凍層-20 ℃保存。（1）miR-767-3p水平檢測：采用PCR 法檢測組織miR-767-3p 表達[8]。使用TRIzol 試劑從組織中提取總RNA。用反轉錄試劑盒將提取的總RNA 逆轉錄為cDNA，后PCR 擴增儀中擴增，反應體系20 μL，反應條件為預變性95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，擴增60 ℃44 s，40 個循環，以U6 作為內部對照，以2-ΔΔCt法計算miR-767-3p 相對表達量。U6snRNA 引物序列：TTCGTGAAGCGTTCCATATrrT；miR-767-3p 引物序列：TCTGCTCATACCCCATGGTTTCT。（2）采用免疫組化法分別對E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和Vimentin 的表達檢測，操作方法：中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，烤片，然后酒精梯度洗脫。用pH8.0 EDTA 修復液進行高壓加熱抗原修復，TBST沖洗，沖洗后用過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶。切片滴加E-cadherin 抗體（ab40772）/N-cadherin 抗體（ab76011）/Vimentin 抗體（ab92547）/β-ccatenin抗體（ab32572）等單克隆抗體（均由北京中杉公司提供）。接著孵育1 h，用DAB 試劑染色，沖洗用蘇木素復染后，脫水干燥，中性樹膠固定。細胞胞膜出現棕黃色顆粒為陽性細胞。顯微鏡（×400）視野下觀察陽性細胞百分比及染色強度，觀察多個視野，以判定標準陽性細胞百分比評分與染色強度評分的乘積≥3 分為陽性表達。標準如下：陽性細胞按≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、≥76%分別記為0、1、2、3、4 分；染色強度根據未染色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0、1、2、3 分。

1.3 統計學處理 采用SPSS 21.0 統計軟件處理數據，符合正態性分布的計量資料采用（）表示，兩兩比較行t檢驗，多分類的計量資料行F檢驗，多組兩兩比較行SNK-q檢驗；計數資料以率（%）表示，組間對比行χ2檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。定距和定類資料相關性分析，用單因素方差分析F檢驗，用η（eta）系數來度量關聯強度，E2＞0.16，存在強相關；0.16≥E2≥0.06，存在中度的相關關系；E2＜0.06，相關程度比較微弱。

2 結果

2.1 癌組織和癌旁正常組織的miR-767-3p 和EMT指標 結直腸癌患者的癌組織中miR-767-3p 表達量明顯高于癌旁正常組織，E-cadherin 陽性率明顯低于癌旁正常組織，N-cadherin 陽性率、β-catenin陽性率、Vimentin 陽性率均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 癌組織和癌旁正常組織的miR-767-3p和EMT指標

2.2 結直腸癌組織中miR-767-3p 和EMT 相關蛋白的表達 以CRC 癌組織中的miR-767-3p 表達的中位數（4.63）為界限值，將CRC 患者分為miR-767-3p 高表達組和低表達組。E-cadherin（+）的miR-767-3p 表達量明顯低于E-cadherin（-），且miR-767-3p 高表達組的E-cadherin（+）比例顯著低于低表達組（P＜0.05）；N-cadherin（+）的miR-767-3p 表達量明顯高于N-cadherin（-），且miR-767-3p 高表達組的N-cadherin（+）比例顯著高于低表達組（P＜0.05）；β-catenin（+）的miR-767-3p 表達量明顯高于β-catenin（-），且miR-767-3p 高表達組的β-catenin（+）比例顯著高于低表達組（P＜0.05）；Vimentin（+）的miR-767-3p 表達量明顯高于Vimentin（-），且miR-767-3p 高表達組的Vimentin（+）比例顯著高于低表達組（P＜0.05）。見表2、3。

表2 結直腸癌組織中EMT相關蛋白的不同表達的miR-767-3p表達量比較（）

表2 結直腸癌組織中EMT相關蛋白的不同表達的miR-767-3p表達量比較（）

表3 miR-767-3p高表達組、低表達組EMT相關蛋白的表達比較[例（%）]

2.3 miR-767-3p 在不同臨床病理特征結直腸癌組織中的表達 不同浸潤深度的腫瘤組織miR-767-3p 比較，差異無統計學意義（P＞0.05），且在miR-767-3p高表達組和低表達組上的分布差異無統計學意義（P＞0.05）；腫瘤的不同分化程度、轉移情況和TNM 分期的miR-767-3p 比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；高分化的腫瘤的miR-767-3p 表達量顯著低于中、低分化的腫瘤（P＜0.05）；而在miR-767-3p 高表達組中，低分化程度的腫瘤比例（45.71%）比低表達組（11.43%）更高；有腫瘤轉移的癌組織中miR-767-3p 表達量更高，而miR-767-3p 低表達組中無腫瘤轉移的比例（85.71%）更高；TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期的癌組織中miR-767-3p 表達量顯著高于Ⅲ期和Ⅳ期，且高表達組中Ⅰ～Ⅱ期比例（54.29%）明顯更高。見表4、5。

表4 不同臨床病理特征結直腸癌組織中的miR-767-3p表達

2.4 結直腸癌組織的miR-767-3p 表達量與上皮-間質轉化、腫瘤病理特征的關系及相關程度 癌組織中miR-767-3p 表達量與E-cadherin、N-catenin、Vimentin 表達存在相關關系（P＜0.05），且E2＞0.16，相關程度強；癌組織中患者的miR-767-3p 表達量與β-cadherin 表達存在相關關系（P＜0.05），0.16≥E2≥0.06，存在中度的相關關系。癌組織中患者的miR-767-3p 表達量與腫瘤分化程度、TNM 分期存在相關關系（P＜0.05），且E2＞0.16，相關程度強；癌組織中患者的miR-767-3p 表達量與腫瘤的轉移情況存在相關關系（P＜0.05），0.16≥E2≥0.06，存在中度的相關關系；癌組織中患者的miR-767-3p表達量與浸潤深度無相關關系（P＞0.05）。見表6。

表5 miR-767-3p高、低表達組的臨床病理特征比較[例（%）]

表6 miR-767-3p與不同EMT蛋白、侵襲和轉移的相關程度

3 討論

miRNA 為長度在19～30 個核苷酸之間的非編碼RNA，參與各種生物學和病理過程，包括腫瘤細胞增殖、存活、凋亡和腫瘤發生[5]。在過去二十年里，大量研究發現疾病都有特殊的miRNA 表達譜，與正常組織中的表達不同，這些差異同時在癌癥中發現，因此miRNA 目前作為基因表達調節劑被廣泛研究癌癥的新診斷標志物和治療靶點[9-11]。miR-767 可根據核苷酸的排列分為miR-767-3p 和miR-767-5p，后者目前在國外廣泛用于尋找腫瘤的新治療靶點，而miR-767-3p 在腫瘤方面的研究的相關報道較少。但有研究發現CRC 患者的癌細胞和外周血組織中miR-767-3p 相對健康人群高表達[12]。EMT 是腫瘤細胞惡性過程，侵襲和轉移的重要機制之一，主要表現為上皮細胞形態、細胞極性和緊密連接喪失，細胞間黏性降低，以及向具有侵襲性和轉移性能力的間質細胞形態的轉化[13]。因此本研究通過對CRC 患者的病理標本檢測觀察miR-767-3p、EMT 相關蛋白表達情況并結合患者的病理特征，分析miR-767-3p 的不同表達與癌組織的侵襲和轉移的關系。

在本研究中，CRC 患者癌組織和癌旁正常組織中miR-767-3p、E-cadherin 陽性率、N-cadherin 陽性率、β-catenin 陽性率、Vimentin 陽性率均有顯著性差異，癌組織中miR-767-3p 表達水平高于癌旁正常組織中，EMT 蛋白的表達異常均傾向EMT過程變化。說明在CRC 患者癌組織不同于癌旁正常組織，出現了miR-767-3p 高表達和EMT 過程。這結果與劉霞等[12]的研究相符，且提供了進一步研究的基礎。

在本研究中，癌組織患者EMT 各蛋白不同表達下的miR-767-3p 的表達量均顯著不同，E-cadherin（+）者miR-767-3p 的表達量明顯更低，N-cadherin（+）者、β-catenin（+）者、Vimentin（+）者miR-767-3p 的表達量均明顯更高，體現不同miR-767-3p 表達量的癌組織與EMT 的進程有所不同。以CRC 癌組織中的miR-767-3p 表達的中位數4.63 為界限值，將CRC 患者分為miR-767-3p高表達組和低表達組，EMT 各蛋白的表達在高表達組和低表達組上分布有顯著差異，高表達組的E-cadherin 陽性率更低，而N-cadherin、β-catenin、Vimentin 陽性率更高。在相關性分析中，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 與miR-767-3p的表達都有強相關性，β-catenin 與miR-767-3p 的表達中等相關，以上結果均可表明miR-767-3p 的高表達很可能與EMT 過程有關。在腫瘤中EMT 通常表現為E-鈣黏蛋白轉化為N-鈣黏蛋白，這種轉化表現為上皮細胞標志物（E-cadherin）的下調表達和間充質細胞標志物（N-cadherin 和Vimentin）的上調表達，同時可能出現β-catenin 的入核，激活Wnt/β-catenin 通路，這些蛋白是EMT 發生和發展的基本標志物[14-15]。有研究報告，E-cadherin、β-catenin、N-cadherin 和Vimentin 的表達與臨床病理特征（如局部腫瘤分化和遠處轉移）和患者預后不良之間存在顯著相關性[16-17]。與本研究中miR-767-3p、EMT 相關蛋白、腫瘤病理特征結果與上述描述相符。miR-767-3p 異常表達導致CRC 癌組織EMT 進展的具體作用的信號通路或基因上尚未明確，在其他腫瘤細胞（人黑色素瘤、膠質瘤、非小細胞肺癌）中，其通過靶向TET 基因，降低TET1和TET3 的活性，導致抑癌基因5-羥甲基胞嘧啶（5-mC）水平降低，調節腫瘤細胞DNA 甲基化，減少對E-cadherin 的保護和減少對Wnt/β-catenin 通路的抑制，誘發EMT 和轉移[18-20]。

腫瘤病理方面，miR-767-3p 的表達與腫瘤的分化程度、TNM 分期強相關，具體表現為高分化的腫瘤的miR-767-3p 表達量顯著低于中、低分化的腫瘤；而在miR-767-3p 高表達組中，低分化程度的腫瘤比例相比低表達組更高。TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者癌組織中miR-767-3p 表達量顯著高于Ⅲ期和Ⅳ期，且高表達組中Ⅰ～Ⅱ期患者比例（54.29%）明顯更高；總體表現為miR-767-3p 表達量越高，腫瘤分化越低，且Ⅰ～Ⅱ期患者多數miR-767-3p 高表達。結果與劉霞等[12]和劉寒梢等[21]研究相符。具體機制可能與上述miR-767-3p 高表達誘發EMT 和轉移有關。

綜上所述，miR-767-3p 高表達與上皮-間質轉化密切相關，同時與腫瘤的病理特征有關，推測癌組織中miR-767-3p 表達水平升高可能通過促進EMT 發生導致癌組織侵襲和轉移，但具體機制還有待后續研究證明。