蛹蟲草菌株退化機制研究進展

余碧霞，哈滿林，李 萍，金季也

（安慶職業技術學院農林與服裝學院，安慶 246003）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）屬麥角菌科蟲草屬，又名北冬蟲夏草，是蟲草屬的模式種，2019年入選《中華人民共和國農業植物品種保護名錄》（第十一批），含有蟲草素、蟲草多糖等多種活性成分，在抗腫瘤、增強免疫力等方面具有很好的藥理作用[1-5]。蛹蟲草現已列為易危菌類，可通過人工栽培解決野生資源嚴重不足的情況。但在蛹蟲草栽培時，易發生菌株退化現象。從野外采集的菌株經3～5代傳代，菌種保藏時不適宜的溫度、光照、氧氣環境條件，培養基中不適宜的營養元素，菌株交配型的改變與基因變異等均會導致菌種退化，表現為菌絲生長速度慢、菌絲活力低、子實體產量下降、畸形或不產生子實體、有效活性成分降低等[6-7]。菌株退化具有可遺傳性，給生產帶來極大風險。研究蛹蟲草菌株退化的表型特征與退化機制，為生產甄別退化菌株與菌株復壯提供理論依據[8]。

1 菌株退化的表型特征

1.1 形態特征

蛹蟲草屬絲狀真菌，經多次繼代培養發生菌株退化。固體培養時，菌落出現扇形、半月形和放射形局變現象，氣生菌絲旺盛，菌絲顏色變淺，產孢數量減少，菌株生長的節律環不明顯[9]；液體培養時，菌株培養液渾濁，菌絲球之間黏連，單個菌絲球不明顯，呈粥糊狀[10]。有的發生菌絲自溶現象，分生孢子聚集在一起呈頭狀，顯微鏡下觀察，發現菌絲分枝多，呈纖細彎曲的不規則狀，皺縮菌絲數量增加，退化程度加重[11]。子實體形成階段，見光轉色慢或不轉色，產量下降，形態纖細，沒有子囊殼，或只形成類似子實體原基的菌絲體[12-13]。

1.2 生理生化特征

蛹蟲草退化菌株生長速率早期逐漸降低，第18天左右開始加快，細胞內小液泡增多增大，細胞壁皺縮變形、縊裂，細胞核數量減少，線粒體分布密集、體積變小，膜邊體減少，圓球體溶解，形成脂滴和嗜鋨顆粒[14-15]。退化菌株體內類胡蘿卜素、纖維素酶、淀粉酶、胞外多糖、蟲草多糖、腺苷、脂質、蟲草素含量降低，麥角甾醇含量與轉代次數呈負相關，急驟下降，體內過氧化氫酶（CAT）、單脫氫抗壞血酸酶（MDHAR）、氧化酶（GR）活性降低，而胞內多糖、生長點活性氧含量升高。構巢曲霉的谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）基因在菌株體內過量表達，使菌株具有更高的GPX活性，可增強清除細胞內活性氧的能力[16-18]。退化菌株細胞自噬基因Atg22、Atg22-2、Atg13、Atg18表達量上升，分別為336.06%、61.01%、432.19%、170.45%，培養液中添加合成染料BTB，顏色變成綠色或藍色，pH升高至6.9～7.9，總糖含量隨傳代次數增加而下降，總蛋白含量呈先下降再升高的趨勢[19]。退化菌株體內各成分含量的變化可作為早期檢測的標志。

2 菌株退化機制

栽培中，發生菌株退化是多種因素共同作用導致，使菌株表型改變、代謝產物下降。研究發現引起蛹蟲草退化的原因主要為環境因素和菌株遺傳因素兩方面[20-21]。

2.1 環境因素

蛹蟲草菌株在全黑暗條件，不適宜的保藏溫度、保藏時間均可引起菌株退化。4 ℃低溫菌種可保藏1～2個月，10～20 ℃菌種只能保藏1個月。蛹蟲草菌種長期保藏時，超低溫、缺氧等方式可降低菌絲細胞代謝速率，有效降低菌種退化速率，但長期低氧環境下，菌株發生突變的可能性增加[22-23]。長時間光照有利于菌絲轉色，細胞內活性氧含量隨之增高，活性氧含量過量積累是導致蛹蟲草菌株退化的重要因素[24-25]。

培養基中一定濃度K+、Ca2+、Zn2+能延緩菌株退化，而Mn2+、Mg2+加速菌株退化[26]。蔗糖或葡萄糖小分子碳源，對菌絲體生長有一定促進作用，利于菌絲細胞吸收養分，提高菌絲質量和子實體產量，淀粉作為碳源時菌絲狀態和生長速度最差；蛋白胨、蛋清液、魚粉作為氮源時易被菌絲吸收，是最佳的氮源。一定濃度的Cr3+增加菌絲協迫作用，但可提高菌株子實體生物量和有效活性成分[27-29]。

2.2 遺傳因素

2.2.1 交配型基因缺失 蛹蟲草是典型二極性異宗配合子囊菌，具有子囊菌交配型位點同位異源結構，即同一位點存在兩類不同交配型基因。蛹蟲草有性生殖受交配型基因控制，不同交配型基因的菌株通過親和性交配形成雙核菌絲，再形成子實體[30-31]。含有MAT-HMG（MAT1-2-1）和MAT-alpha（MAT1-1-1、MAT1-1-2）兩種交配型基因是異核體菌株，可進行有性生殖，栽培可形成子實體；只含有MAT-HMG（MAT1-2-1）或MAT-alpha（MAT1-1-1、MAT1-1-2）兩種交配型基因中一種的是同核體菌株，栽培不形成子實體。可見交配型基因的缺失是蛹蟲草退化的主要因素之一。

2.2.2 堿基突變 蛹蟲草菌株傳代次數增加，堿基發生變異的可能性增大，菌株傳代到第5代時，比原始菌株ITS序列不同位點發生2～3處堿基突變[32]。對蛹蟲草的ITS 5.8S、18S、28S區域進行檢測，ITS+5.8S+ITS2、28S區域沒有發生變化，退化菌株在18S區域7處堿基發生突變，在5.8S+ITS區域，退化菌株在第279和360個堿基處發生T到C轉換[33]。利用PCR-RFLP（限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應）和RAPD（隨機擴增多態性DNA標記）技術發現，蛹蟲草退化菌株在DNA水平上突變頻率高于正常菌株，限制性XspI內切酶在退化菌株上沒有酶切位點，這可能與蛹蟲草菌株退化相關。

2.2.3 基因差異 全基因組測序分析發現，蛹蟲草菌株體內有多種光受體基因，敲除藍光受體基因Cmwc-1時，菌株在光照下不發生變色，影響原基和子實體形成，類胡蘿卜素及蟲草素合成受阻，分生孢子數量降低[34-35]。而Cmcry-dash缺失會降低Cmwc-1基因表達[36]。一些光受體基因是菌株退化的可能因素。

蛹蟲草單分生孢子菌株進行連續繼代培養，對第1代、第3代和第5代菌株形成的原基進行轉錄組測序，共檢測到10 901個基因，發現3 229個差異表達基因（DEGs）。第5代與第3代相比，DEGs的數目總和為2 099；第3代與第1代相比，DEGs的數目總和為656，說明分生孢子傳代到第3代是菌株退化的開始，且隨著傳代次數增加，DEGs數量不斷增多。對3 229個DEGs進行GO富集分析，發現DEGs在生物過程中的GO富集主要表現在跨膜轉運過程，毒素、霉菌、次生代謝產物的生物合成過程和代謝過程，表明菌株退化與這些生物的合成與代謝過程有關。對DEGs進行KEGG富集分析，發現第5代與第1代相比的2 366個DEGs與第5代與第3代相比的2 099個DEGs有相似的富集通路：酪氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、谷胱甘肽代謝、苯丙氨酸代謝，表明這些代謝通路可能與菌株退化有關。

DNA甲基化蛋白使退化菌株與正常菌株產生基因表達差異，退化菌株中CmDim-2、CmHh3、CmHmd、CmM16、CmLsd、CmHn和CmMfl7個甲基化基因表達量顯著升高，而CmHln、CmDmta和CmSam基因表達量顯著降低，通過基因敲除試驗發現，甲基化相關基因參與蛹蟲草的菌株生長速度、分生孢子產量、孢子萌發速率和菌絲尖端生長，與交配型基因在菌株退化過程中起協同作用[37]。

3 預防菌株退化的措施

3.1 適宜的環境條件

低溫黑暗是蛹蟲草菌種長期保藏的主要環境。菌種短期保藏，晝夜5～10 ℃變溫、一定量的散射光可較好保持菌種性能，菌絲生長健壯、具有整齊的菌落邊緣、生長速度快、角變面積小、轉色快、子實體品質優良，較4 ℃恒溫黑暗保藏效果好。菌種保藏時間超過30 d，菌種質量顯著下降。菌種保藏時間超過1年，4 ℃低溫黑暗保藏效果較好。在培養基中添加0.5%瓊脂對防止水分蒸發有一定作用，密封口用無菌膠塞代替棉塞，可有效防止雜菌種污染[38]。

3.2 適宜的培養條件

在蛹蟲草培養基中添加1.5%的組氨酸和0.64%的賴氨酸明顯降低菌絲色素退化[39]。分別添加1.0 g·L-1K+、0.02 g·L-1Ca2+、250 μg·L-1或375 μg·L-1Zn2+能延緩菌落退化。蔗糖或葡萄糖等小分子碳源，蛋白胨、蛋清液等有機氮源，蠶蛹粉等復合氮源，一定濃度IAA等植物生長激素，維生素C，粉色光均有利于菌絲生長，可提升蟲草素的活性成分含量，提高菌種品質。

3.3 減少傳代次數

研究發現蛹蟲草菌種在傳代培養時，第3代開始出現退化現象，傳代次數越多，菌種發生變異和退化的可能性越大，生產中盡量減少傳代次數。用液體菌種替代固體菌種，可延遲菌種退化發生的時間。

4 菌株復壯技術

4.1 組織分離法

選擇生長期10～20 d性狀優良、顏色純正具有品種特性的優質子實體，或野外采集的子實體，75%酒精消毒，無菌水沖洗5次，吸干水分，在無菌操作臺上挑取上部菌體1 mm×1 mm接種于斜面培養基，22～25 ℃培養箱內培養15 d，待菌絲布滿斜面，接種到大米栽培培養基進行子實體培養，人工選擇得到優良菌株[40]。

4.2 單孢分離雜交法

將無菌培養獲得的優良成熟子實體，在三角瓶上方固定，待孢子散落在三角瓶中，收集子囊孢子，采用稀釋涂布平板法獲得單孢菌落，以交配型為標記，選擇含有MAT1-1和MAT1-2的分生孢子和子囊孢子進行雜交，將獲得的雜交菌株進行子實體培養，篩選獲得優良菌株[41]。

4.3 蟲體回接法

將退化的菌種接種到液體培養基中獲得菌懸液，用醫用注射器取0.2～0.4 mL菌懸液注射到70%～75%酒精消毒的活柞蠶蛹體內，置于消毒瓶中16～18 ℃培養約50 d，待子實體長出，采用組織分離法挑取菌絲體接種到PDA培養基上，培養篩選得到優良菌株。

4.4 物質添加法

將退化菌株接種到含有0.1 mg·mL-1氨芐青霉素，或0.2 mg·mL-1卡那霉素，或0.025 mg·mL-1小諾霉素+頭孢霉素IV的培養基中進行第一次復壯培養3 d，再分別接種到含有添加0.3 mg·mL-1氨芐青霉素，或1 mg·mL-1鏈霉素，或1 mg·mL-1卡那霉素+0.3 mg·mL-1氨芐青霉素的培養基上進行第二次復壯培養3 d，轉接到PDA培養上培養，菌株菌絲生長速度大幅提高，菌絲體粗壯、致密，子實體產量大幅提高[42]。在100 mL MM培養基中添加9.375 g真姬菇菌渣（菌渣采用53.125 g大米、42%玉米芯、25%雜木屑、12%米糠、15%麩皮、6%玉米粉培養真姬菇），進行菌株培養，菌絲中蟲草素、腺苷含量增加，子實體產量提高[43]。

4.5 原生質體誘變融合法

蟲草屬真菌，利用原生質體融合和誘變技術，打破種屬不親和現象，實現基因交換與重組，產生新的基因型。蛹蟲草育種時采用父本或母本滅活與正常活性原生質體融合，或父母本均采用藥物、紫外線誘變等滅活，融合子受損位點互補而具有活力，原生質體融合后，25 ℃培養再生菌落，待菌絲體長滿進行優良融合子篩選，獲得性狀穩定的優良菌株[44-45]。

5 結 論

蛹蟲草菌株發生退化時，其形態特征和生理生化特征會發生明顯改變，可通過直接觀測菌落形態，顯微鏡觀測菌絲結構、分生孢子形態，利用TTC-脫氫酶還原法[46]、溴麝香草酚藍指示劑法[47]、HPLC法、總糖含量測定（GB/T 15672-2009）、考馬斯亮藍G250法[19]、氮藍四唑NBT檢測法[48]測定脫氫酶活性、退化菌株的培養基顏色、蟲草素含量、培養基中總糖、培養基中總蛋白含量、菌絲活性氧含量，采用PCR擴增測序[17]、q RT-PCR檢測差異基因表達[19]，為生產中甄別退化菌株提供理論依據。

僅篩選退化菌株不能促進產業發展，需要采用適宜保藏條件、培養條件等延緩菌種退化時間，還需采用適宜的菌株復壯技術進行菌株復壯，降低生產風險，目前采用的菌株復壯方法主要包括組織分離法、單孢分離雜交育種法、蟲體回接法、培養基中添加抗生素等物質、原生質體誘變融合等。

目前對蛹蟲草菌株退化的研究主要包括環境因素及菌株本身的遺傳特性兩方面，其中遺傳因素是起主導作用的因素。了解菌株退化機制，才能有效解決菌株退化問題，蛹蟲草菌種退化的研究方向包括探明退化相關基因的調控通路與有效成分合成途徑、差異表達基因的功能、基因工程改造技術等。