葉酸改善卵泡液中同型半胱氨酸水平和氧化應激反應對卵母細胞發育潛能的影響

鄭可欣，張 寧

（1.濱州醫學院第二臨床醫學院，山東 煙臺 264003 ；2.煙臺毓璜頂醫院生殖醫學科，山東 煙臺 264099）

在輔助生殖治療過程中，獲得具有受精能力和發育潛能的優質卵母細胞對妊娠結局至關重要[1]。在卵泡生長發育過程中，卵泡液為卵母細胞提供了特殊的內分泌營養環境。異常的卵泡組成可影響卵母細胞的生長、發育和成熟。在卵母細胞發育過程中，卵泡液中的氧化應激現象可造成卵母細胞線粒體的損傷、三磷酸腺苷（ATP）缺乏、減數分裂異常和染色體非整倍體數目增加，進而損害卵母細胞的發育潛能[2]。同型半胱氨酸的主要不良作用為引起或加重氧化應激現象，導致卵母細胞發育潛能降低。葉酸作為一碳單位載體參與DNA、RNA、蛋白質的合成，具有促進甲基化反應、細胞分裂、核酸合成以及抗氧化的作用，可防止卵母細胞氧化損傷，促進卵母細胞減數分裂和成熟，保證卵母細胞的遺傳穩定性。補充葉酸可減輕同型半胱氨酸和氧化應激反應對卵母細胞的損傷，從而提高卵母細胞的發育潛能，增加輔助生育治療的成功率。

1 氧化應激

1.1 氧化應激現象

活性氧(reactive oxygen species，ROS) 是生物體內活性含氧化合物的總稱，包括超氧自由基、過氧化氫、羥自由基等。在卵母細胞及胚胎發育的微環境中，由氧氣參與新陳代謝所產生的活性氧如得不到及時清除，會誘導氧化應激的現象[2]。在輔助生殖過程中活性氧的產生主要來自兩方面：（1）由配子和胚胎自身代謝產生，相關反應過程包括氧化磷酸化和細胞凋亡；（2）在周圍環境因素的影響下產生，影響因素包括培養基中氧氣濃度、吸煙、年齡和可導致生育力低下的疾病〔包括子宮內膜異位癥、多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）、早發性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）等〕[3-4]。正常生理條件下，機體的氧化/ 抗氧化水平處于動態平衡狀態。ROS 會在體內不斷產生和被清除，這使ROS 濃度處于動態平衡狀態。當機體抵抗ROS 的能力下降時，相關動態平衡就會被打破，導致細胞功能異常[5]。在輔助生殖過程中，細胞氧化代謝產物無法被及時清除，且體外培養的環境會進一步誘發氧化應激反應，導致過量ROS 蓄積，可引起一系列病理狀態，包括生物膜脂質損傷、糖化氧化、DNA 損傷、蛋白質過氧化等，導致細胞凋亡、組織器官損傷和各種疾病的發生[6]。

1.2 氧化應激對卵母細胞發育潛能的影響

機體中ROS 和抗氧化劑可保持一種平衡。生理濃度范圍內的ROS 是卵母細胞成熟、排卵、黃體化、黃體孕酮產生和單卵泡形成所必需的物質[7-8]。當平衡被打破，過量的ROS 會誘發氧化應激，導致卵母細胞老化[9]；同時，過量的ROS 與胚胎碎裂增加、胚胎分裂減少和囊胚形成率降低有關[10]，它可通過造成DNA 損傷、線粒體改變、脂質過氧化和蛋白質氧化來影響未成熟卵母細胞細胞核和細胞質的成熟，從而降低胚胎的發育潛力[11]。在體外培養過程中，卵母細胞和胚胎不可避免地會暴露在光照和比體內更高的氧濃度下，這可能導致過量ROS 的產生，進而引起氧化損傷，影響卵母細胞和胚胎的正常發育。清除體內過多的ROS 對卵母細胞成熟和胚胎發育至關重要[12]。Das 等[13]從78 名接受控制性卵巢刺激的輸卵管性不孕患者的體內采集了208 份卵泡液樣品，并對其進行了ROS 和脂質過氧化物(lipid hydroperoxide，LPO)分析，結果顯示卵泡液中高水平的ROS 會降低卵母細胞的受精潛力，卵泡液中ROS 及LPO 的水平與胚胎質量呈負相關。體內氧化應激水平可以通過相應標記物的水平反映，標記物包括三類：（1）氧化產物類：包括丙二醛（malondialdehyde，MDA）、晚期氧化蛋白產物(advanced oxidation protein products，AOPP)、巰基蛋白；（2）抗氧化酶：包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 等；（3）總氧化能力（total antioxidant capacity，TAC）指標。機體抗氧化系統中的氧自由基可以攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質過氧化。MDA 是脂質過氧化過程中活性最高的非自由基中間體和終產物，其主要衍生出活性羰基物質。研究表明，高水平的MDA 可降低卵母細胞的成熟率，影響受精能力，導致卵母細胞發育潛力下降、高質量胚胎減少以及不良臨床妊娠結局的產生[14]。AOPP 是反映人體氧化應激引起的蛋白質損傷的可靠指標。巰基蛋白可以保持氧化還原狀態，發揮防止氧化損傷的作用[15]。它可誘導還原型谷胱甘肽（glutathione reduced，GSH）的合成，提高配子中GSH 的濃度，促進胚胎發育至囊胚階段[16]。有研究者提出，卵泡液中最重要的抗氧化酶是SOD。研究發現，SOD 濃度及活性較高的卵母細胞具有更高的受精率與卵裂率，形成的胚胎移植后臨床妊娠率更高[17]。Paszkowski 等[10]的研究已證實卵泡液TAC 與卵母細胞成熟率呈正相關，可作為預測人類體外受精成功的指標。Chattopadhayay 等[18]研究指出，在多囊卵巢綜合征患者中，未成熟卵母細胞卵泡液中的TAC 水平低于成熟卵母細胞。Oyawoye 等[19]的研究表明，較高的TAC 水平可提高接受體外受精女性的受精潛力。Mojtaba Kafi 等[20]的研究則證實，將MDA 作為氧化應激標志物的效果比TAC 更好。目前TAC 與卵母細胞發育和輔助生殖技術結果之間的關系仍有很大爭議。Oyawoye 等[21]研究發現，低TAC 與卵子受精不全相關，而與胚胎活力無關。在多囊卵巢綜合征患者中，受精不全與TAC 升高相關。

2 同型半胱氨酸

2.1 同型半胱氨酸的代謝

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是蛋氨酸代謝過程中的中間產物，在體內有甲基化和轉硫兩條代謝途徑，前者使Hcy 重新獲得甲基轉化為甲硫氨酸，后者則經胱硫醚作用生成半胱氨酸。Hcy代謝過程中有三個關鍵酶：亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)、胱硫醚p.合成酶(cystathionine βsynthase，CBS) 及甲硫氨酸合成酶(methionine synthetase，Ms)[22]。目前學者們認為，體內Hcy 水平主要受參與蛋氨酸代謝過程中的三種酶的影響，另外各種輔因子( 如鈷胺素、維生素B6、葉酸) 也對其水平有一定影響[23]。

2.2 Hcy 對卵母細胞發育潛能的影響

Hcy 的主要不良作用是產生活性氧(ROS)，導致細胞分裂減少，產生炎性細胞因子，改變一氧化氮代謝，增加氧化應激，增加細胞凋亡，并導致甲基化紊亂[24]。卵泡液Hcy 濃度與卵子受精率、卵裂率、優質胚胎率呈顯著負相關關系，卵母細胞成熟率會隨著卵泡液中Hcy 濃度的降低而增加[25-26]。卵泡液Hcy水平與卵母細胞質量呈負相關[27]；在受精方面，隨著卵泡液中Hcy 濃度的增加，受精率下降。此外，卵泡液中的Hcy 濃度與卵泡直徑呈負相關，提示卵泡液中Hcy 濃度過高會抑制卵泡的生長，并可能影響卵母細胞的成熟和受精[28]。董麗霞等[29]的研究表明，PCOS患者采卵日血漿和卵泡液中Hcy 的濃度明顯高于非PCOS 患者（P＜0.05），血漿中Hcy 的濃度與卵泡液中Hcy 的濃度呈正相關，卵泡液中Hcy 的濃度與受精率、卵裂率和優胚率呈負相關（P＜0.01）。Luting Chen 等[30]的一項研究表明，在IVF/ICSI 周期中，Hcy 與臨床妊娠和著床率呈高度負相關，尤其是在攜帶MTHFR C677T TT 基因型的女性中。Y Razi 等[31]的研究表明，卵母細胞成熟率＜80% 的女性其卵泡液中Hcy 的濃度高于9.8 μmol/L，大多數優質胚胎為Hcy 水平＜9.8 μmol/L 的胚胎。降低卵泡液中的Hcy 濃度可以顯著提高卵母細胞成熟率和胚胎質量。另外，衰老可能是通過增加卵泡液中Hcy 水平導致胚胎質量和卵母細胞成熟率下降的間接因素。卵泡液中Hcy 濃度的升高可刺激氧自由基的產生，降低機體的抗氧化能力[32]。其還可以通過干擾體內的轉甲基化反應來影響DNA、RNA、蛋白質的合成，從而影響細胞的發育和分化[33]。Priscila Queiroz D’Elia 等[34]的一項前瞻性研究證明在卵泡發育中，高Hcy 血癥可激活細胞凋亡，導致卵泡閉鎖，影響卵母細胞的成熟和體外培養胚胎的質量。超閾值Hcy 可能對卵母細胞具有細胞毒性和基因毒性作用，導致卵母細胞的細胞核或細胞質發生光鏡無法觀察到的異常變化，從而降低卵母細胞質量和發育潛力，影響胚胎著床和正常妊娠的維持[29]。

3 葉酸

3.1 葉酸的代謝

葉酸又稱維生素B9，在體內可被二氫葉酸還原酶還原成為二氫葉酸，繼而還原成為四氫葉酸。四氫葉酸是一碳單位的傳遞體，容易接受或脫離一碳單位(甲基、次甲基、亞甲基、甲烯基) 參與DNA 修復和其他功能。四氫葉酸加甲基后變為10- 甲酰四氫葉酸，之后在10- 甲酰四氫葉酸脫氫酶的作用下變為5，10-亞甲基四氫葉酸，再經MTHFR 作用形成6S-5- 甲基四氫葉酸[35]。葉酸可作為一碳單位載體參與DNA、RNA、蛋白質的合成，具有促進細胞分裂、甲基化反應、核酸合成和抗氧化的作用。在對卵母細胞發育的影響方面，葉酸具有促進卵母細胞減數分裂和成熟，保證卵母細胞遺傳穩定和防止卵母細胞氧化損傷的作用，是胚胎發育過程中必不可少的營養物質[36]。

3.2 葉酸對Hcy 的改善

植入前的胚胎在很大程度上依賴于在卵母細胞生長過程中獲得的內源性還原葉酸池的再循環，主要用于合成嘌呤和嘧啶[37]。葉酸缺乏會影響DNA 甲基化和完整性，增加血液Hcy 水平。卵泡液中Hcy 水平升高與形成不成熟的卵母細胞和質量差的胚胎相關，而MTHFR 基因變異與卵巢儲備降低、卵泡刺激反應減弱和體外受精后活產機會減少相關。攜帶多種MTHFR 變體的胚胎似乎具有選擇性劣勢，研究表明葉酸代謝和相關基因變異的不平衡可能會損害女性的生 育 能 力[38]。Wies?aw Szymański 等[39]的 研 究 結 果顯示，在補充葉酸的較低Hcy 濃度的一組女性中，第一級和第二級成熟度卵母細胞的比例較高，補充葉酸降低了卵泡液和血清中Hcy 的濃度。暴露在低濃度Hcy 下的卵母細胞有更好的質量和更高的成熟度。一項對于卵泡液中適合卵母細胞發育的葉酸和Hcy 濃度的多因素Logistic 回歸分析顯示，卵泡液中葉酸濃度＜14.25 ng/mL 和Hcy ＜4.9nmol/mL 分別是優質胚胎和臨床妊娠的潛在預測指標[40]。Brouwer IA 等[41]的研究表明，健康的年輕女性除日常飲食攝入葉酸外，補充250 μg/d 的葉酸可顯著降低其血漿總Hcy 的濃度。Jolanda CBoxmeer 等[28]的研究表明，卵巢刺激可導致血液Hcy 的水平顯著降低(P ≤0.001)。Hcy 和葉酸在血液中的濃度與其在卵泡液中的濃度密切相關(P ≤0.001)。在補充葉酸的女性中，卵泡液葉酸水平與卵泡直徑呈負相關(P ≤0.05)，提示卵泡液中過多的葉酸可能對卵泡發育產生不利影響。

3.3 葉酸對氧化應激現象的改善

一項對相關隨機對照試驗的系統回顧和薈萃分析表明，補充葉酸可通過增加血清中GSH 和TAC 的濃度來降低血清中MDA 的濃度[42]。此外，葉酸可通過降低ROS 的蓄積來調節卵巢對促性腺激素的反應，從而影響卵巢刺激治療的結果[43]。葉酸可通過增加細胞內的內在抗氧化劑水平使細胞免受氧化應激的傷害。此外，來自葉酸代謝的不同分子對DNA、RNA、蛋白質合成、適當的表觀遺傳活動和染色體結構維護也是必不可少的，這使得葉酸在細胞快速生長和增殖期間（包括生殖細胞成熟、懷孕和受精等過程）不可或缺[44]。

4 總結與展望

卵泡液中的氧化應激反應與Hcy 可通過各種機制影響卵母細胞的發育，研究表明補充葉酸可以改善它們的不利影響，提高卵母細胞的發育潛能。然而，補充過多的葉酸則會起到相反的作用。未來需要更多的隨機對照試驗來確定葉酸的相關臨床療效，探索葉酸提高卵母細胞發育潛能的最適濃度，并通過與個人的葉酸代謝能力相結合來個性化地制定補充葉酸的劑量，以期提高輔助生育的成功率。