磷酸酶和張力蛋白同源基因誘導激酶1與糖尿病難愈創面修復的研究進展

楊嘉琪，張培華，黃海麗

糖尿病是一種臨床高發的慢性代謝性疾病，易伴發包括血管病變及周圍神經病變在內的多種并發癥［1］。慢性難愈創面是糖尿病常見且嚴重的并發癥之一，且缺乏有效的治療方式，是導致糖尿病患者截肢率居高不下的主要原因［1-2］。磷酸酶和張力蛋白同源基因誘導激酶1（PINK1）可能通過調控線粒體功能以及炎性反應、脂質代謝等在糖尿病創面修復過程中發揮重要作用。本文就創面修復的機制，線粒體功能，PINK1與糖尿病難愈創面三者的關系，PINK1在創面修復過程不同階段中的作用等方面進行綜述。

本文文獻檢索策略：本文以“磷酸酶和張力蛋白同源基因誘導激酶1”“糖尿病難愈創面”“創面修復”為中文關鍵詞，以“Phosphatase and tensin homologueinduced putative kinase 1”“PTEN induced putative kinase 1”“PINK1”“diabetic refractory wounds”“wound repair”為英文關鍵詞檢索PubMed、萬方數據知識服務平臺、中國知網等數據庫，并手工檢索納入文獻的參考文獻；檢索時限為建庫至2022年5月；閱讀摘要及全文后納入與本文主題相關的文獻，排除信息量太少而無法有效參考的文獻。

1 皮膚創面修復的機制

1.1 創面修復的過程 創面修復包括4個階段：止血期、炎癥期、增生期以及重塑期。止血期自創面產生開始，創面處血管收縮并開始凝血級聯反應，血小板在此期間釋放出各種蛋白、細胞因子、化學介質，對后續的愈合過程有重要的調節作用［3］。凝血過程中被招募至創面周圍的肥大細胞、中性粒細胞及巨噬細胞相互配合、分工合作，共同清除創面部位的細菌、失活或壞死的組織并促進炎性因子的釋放，為新生肉芽組織提供一個干凈的場地，炎癥期的進展情況直接影響創面愈合的發展方向［4］。糖尿病創面屬于慢性難愈創面，有研究表明這與過度的炎性反應密切相關［5］。當中性粒細胞釋放的白介素1和腫瘤壞死因子α（TNF-α）激活成纖維細胞和上皮細胞，創面修復進入增殖期。在增殖期，修復細胞（角質形成細胞、內皮細胞、成纖維細胞）遷移、增殖，基質生成和降解，新生血管形成，形成新鮮的肉芽組織［6］。重塑期開始于肉芽組織的成分沉積，最終形成瘢痕，完成創面修復［4］。這些活動的組合決定修復的最終結果。

1.2 糖尿病難愈創面的成因 血糖控制不佳、晚期糖基化終末產物（AGEs）蓄積、炎性反應加重、氧化應激反應增加、細胞凋亡增加、微循環障礙等多種病理因素均可導致創面難愈，有研究表明高糖環境誘發的氧化應激可能在延遲創面愈合中發揮關鍵作用［7］。糖尿病患者創面局部持續的高糖環境經過復雜的糖基化過程產生AGEs，蓄積的AGEs與其主要細胞表面受體——晚期糖基化終產物受體（RAGE）結合引發氧化應激，加重炎癥，影響細胞功能和代謝［8］。創面修復過程中，中性粒細胞在炎癥早期釋放適量氧自由基（ROS）清除細菌及異物［9］，吞噬細胞碎片后迅速凋亡并釋放基質金屬蛋白酶（MMP）和彈性蛋白酶等酶，進一步消化周圍的受損細胞［10］。為防止過度損傷，巨噬細胞會及時清除凋亡中的中性粒細胞并由促炎表型M1型向促愈合表型M2型極化，抑制炎癥發展，促進組織再生［11］，巨噬細胞表型轉化是促進創面修復進展的重要因素［12］。研究證實，AGEs蓄積會抑制中性粒細胞的遷移并促進其凋亡，無法及時到達創面基部的中性粒細胞在創面周圍聚集。在AGEs的作用下各種炎性因子的表達上調，ROS、MMP、彈性蛋白酶增加，同時內源性抗氧化酶的表達被抑制，導致氧化應激反應增強［8］，細胞外基質（ECM）嚴重受損［13］，促進愈合的生長因子如血小板衍生生長因子和腫瘤壞死因子-β（TNF-β）減少［14］，研究證實ECM降解平衡異常是創面在炎癥期停滯的主要因素之一［10］。其次，KHANNA等［15］發現糖尿病小鼠創面處巨噬細胞清除功能下降，炎癥消除受阻。有研究證實AGE-RAGE通路阻礙巨噬細胞表型轉換［16］，主要分泌促炎因子的M1型巨噬細胞增多，分泌抗炎因子和促修復細胞因子的M2型巨噬細胞減少，導致修復細胞增殖和遷移減少，創面愈合受阻［17］。此外，研究證實AGEs可能會惡化糖尿病患者的血糖情況，導致炎性反應以及氧化損傷進行性加重［18］，最終形成糖尿病慢性難愈創面。

2 線粒體功能與糖尿病難愈創面的關系

2.1 2型糖尿病導致脂肪組織線粒體異常 線粒體在細胞穩態、細胞凋亡、ROS生成、能量底物代謝中起重要作用［19-20］。線粒體除了作為能量供應細胞器，還可作為能量傳感器。線粒體的穩態常與代謝相關的疾病密不可分［21］。線粒體可能在難愈創面的形成過程中發揮關鍵作用。有研究發現，2型糖尿病患者或db/db小鼠（2型糖尿病動物模型）脂肪組織中線粒體表現出功能障礙或減少現象［22-23］。另有研究顯示，與非糖尿病正常體質量對照組相比，肥胖的2型糖尿病患者則會顯示出異位脂質的累積［24］，線粒體來源ROS增加，抗氧化酶下降［25］，其中抗氧化酶的減少被證實會降低胰島素敏感性［26］，加重高血糖狀態，形成惡性循環，加速疾病進展。

2.2 氧化應激損害細胞功能 線粒體是胞內ROS的主要來源，卻也易受ROS引起的氧化損傷影響［27-28］，適量的ROS對于維持細胞功能是必要的，包括基因表達、分子信號傳達、蛋白質翻譯后修飾、控制細胞的增殖分化，維持細胞衰老等［29］。過量的ROS會導致氧化應激損害細胞生理功能［30］。通常，線粒體具有自限性反饋機制來減弱線粒體ROS的產生［31］，但AGEs蓄積會降低內源性抗氧化酶的生成，破壞體內氧化還原平衡；其次，過量的ROS會促進線粒體分泌細胞死亡相關分子（DAMPs）激發炎性反應［32］，線粒體分泌的多種DAMPs導致促炎細胞因子分泌增加、細胞代謝改變和炎癥誘導。

為保證線粒體的健康和穩態、避免細胞凋亡，線粒體通過裂變/融合平衡進行質量控制。多數損傷線粒體通過裂變激活自噬進行降解，另一部分損傷程度輕的線粒體被選擇性融合進健康的線粒體網絡進行成分再分配，挽救線粒體功能，防止過度碎片化［33-34］。自噬是一種細胞自衛機制，分為非選擇性和選擇性，在正常的生理件下，適度的自噬水平有利于維持穩定的細胞內環境和應對不利環境［35］。因此，在創面修復過程中線粒體調控細胞凋亡的這一功能較其他功能具有更重要的意義。

3 PINK1功能

3.1 PINK1介導線粒體自噬 PINK1是絲氨酸/蘇氨酸激酶家族中的一員。作為線粒體功能障礙的監測器，PINK1能持續監控線粒體狀態，識別受損線粒體，并啟動選擇性自噬程序清除受損線粒體，維持細胞內穩態。PINK1主要分布于線粒體外膜，屬于線粒體自噬信號級聯反應中的上游因子，與其下游因子E3-泛素連接酶Parkin蛋白一起介導線粒體自噬。首先，PINK1在受損線粒體外膜上活化并蓄積［36］，通過磷酸化附著在線粒體外膜蛋白上的泛素絲氨酸（Ser）65觸發起始信號向細胞傳遞損傷信息［37］。近期研究發現，在PINK1中，Ser228磷酸化是將PINK1轉化為泛素激酶的先決條件［38］。隨后Parkin蛋白被選擇性地招募至受損線粒體外膜并被活化以促進線粒體自噬［39］，并泛素化線粒體外膜上相關蛋白，活化的Parkin蛋白通過延長泛素鏈形成泛素基團，泛素基團結合自噬受體蛋白，最后通過自噬適配器形成自噬小體，完成線粒體自噬［40］。在此過程中，完全活化的Parkin蛋白可以為PINK1提供更多磷酸化底物，又反過來募集和活化更多Parkin蛋白，形成正反饋環，從而擴大線粒體自噬信號［41］。此外，研究提出PINK1可以不通過Parkin蛋白通路直接激活線粒體自噬［41］，這表明PINK1可以通過不同途徑調控自噬。

3.2 PINK1其他功能 越來越多的證據表明，PINK1通過除自噬外的其他途徑參與調控細胞代謝和活性。ARENA等［42］發現PINK1能通過磷酸化Bcl-xL（一種抗凋亡蛋白）的Ser62對抗氧化損傷引起的細胞凋亡，其次，該作者在另一篇研究中提出PINK1也可能通過調節Ca2+穩態以增強呼吸鏈功能維持線粒體功能［43］；PINK1的下調導致糖尿病患者體內脂滴聚集和線粒體脂肪酸氧化證實了PINK1能夠影響脂質代謝［44］；PINK1對神經元有保護作用，MARTELLA等［45］發現PINK1能夠提高線粒體對魚藤酮等線粒體毒性物質的拮抗能力；AKUNDI等［46］發現PINK1基因敲除的哺乳動物細胞內出現線粒體碎片化、擴大及腫脹等異常形態，部分線粒體伴隨Parkin蛋白募集或去極化，證實PINK1能夠影響線粒體形態［47］。

4 PINK1與2型糖尿病及其難愈創面的關系

PINK1突變是帕金森綜合征的主要原因之一［48］，但PINK1除神經保護作用外的其他功能正在被逐步挖掘［43］。實驗證實，PINK1介導的線粒體自噬可以通過影響胰島β細胞的Ca2+穩態、葡萄糖感知及攝取能力和胰島素抵抗參與糖代謝過程調控2型糖尿病［49］。有研究表明，PINK1缺乏是2型糖尿病的潛在發病因素［50］。BHANSALI等［51］發現，輕度高血糖能上調線粒體自噬以保證β細胞功能，中度或高度高血糖會導致PINK1/Parkin表達下調損害線粒體自噬，高血糖誘導的氧化應激造成線粒體功能紊亂及ROS清除功能下降，進而導致過度的炎性反應和細胞修復能力下降。此外，線粒體自噬的下調會促進巨噬細胞向M1型極化［52］，進一步促進炎性反應。這些因素與前文所提到的難愈創面的成因高度契合，這證實PINK1對糖尿病及其難愈創面存在重要影響作用。

5 PINK1在創面修復中的作用

5.1 PINK1在創面修復炎性反應階段的作用

5.1.1 PINK1對抗內外界氧化脅迫 2型糖尿病患者的創面在持續的高糖微環境下會產生大量AGEs、TNF-α、脂多糖等因子，增強氧化應激反應及加重炎性反應，而這是阻礙愈合的關鍵原因。過量的ROS會破壞抗氧化防御系統，引發氧化應激損傷細胞。研究表明，PINK1可以通過不同途徑參與對抗氧化應激。第一，為避免過度的細胞損傷，PINK1通過介導選擇性自噬不斷清除產生過量ROS的異常線粒體。在人腎皮質近曲小管上皮細胞（HK-2）中，當PINK1介導的線粒體選擇性自噬減少時，會導致線粒體ROS（mtROS）產生增多以及DNA氧化損傷，加重造影劑誘發的急性腎損傷［53］。同樣，在外界高氧誘導下，PINK1的缺乏會增加肺內皮細胞中線粒體氧化劑和mtROS的產生，加重肺部損傷［54］。以上研究表明PINK1介導自噬能有效對抗內外界氧化損傷。第二，PINK1通過自噬以外的途徑對抗氧化應激。QASIM等［55］報道了PINK1可以通過磷酸化Ser637位點的激肽相關蛋白1（DRP1）抑制細胞凋亡，減少在腸缺血再灌注時期過量的ROS釋放導致的細胞損傷。ARENA等［42］發現PINK1能通過磷酸化Ser62位點的Bcl-xL對抗細胞凋亡。此外，研究發現的調控PINK1表達的上游因子正在逐漸增多，MURATA等［56］對PINK1 mRNA在脅迫條件下的轉錄調控進行研究后提出，Nrf2（一種抗氧化劑轉錄因子）能夠上調人神經母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）中PINK1的轉錄表達，增強其線粒體保護作用，提高細胞存活率。值得注意的是，在不同細胞譜系中，Nrf2對PINK1的轉錄調節具有差異性。MEI等［57］發現FOXO3a在生長因子/血清減少時調節T淋巴細胞中PINK1的表達。但在SH-SY5Y細胞中，Nrf2誘導的PINK1表達水平遠高于FOXO3a。

5.1.2 PINK1介導線粒體自噬抑制NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）的激活 研究顯示，過量的mtROS［58］和氧化線粒體DNA（mtDNA）在中性粒細胞凋亡期間能夠激活NLRP3炎癥小體［59-60］。NLRP3炎癥小體是炎癥體中被研究的最廣泛的一種炎癥復合體，是激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-1，細胞凋亡的主要介質之一）的多蛋白復合物，可誘導促炎細胞因子白介素1β和白介素18的成熟，也可被多種刺激物激活，并刺激自身免疫的加強，強化炎性反應［61］。從該角度出發，尋找調節NLRP3激活的相關機制或能成為防止過度炎性反應的重要突破口。研究顯示，線粒體自噬級聯反應能夠將功能異常的線粒體清除并降低 mtROS［62］；ZHOU 等［63］證實了 NLRP3 受到自噬的負性調節，且PINK1是介導自噬的主要上游因子之一。關于PINK1調節NLRP3炎癥小體激活具體機制的研究較少，現有的研究以PINK1調控自噬清除受損線粒體為主要機制多關注上游調節因素及其相關疾病。MOUTON-LIGER等［64］將PINK1與免疫細胞核因子κB（NF-κB）途徑的負調節因子的抗凋亡信號蛋白20AD（A20）聯系起來，提出PINK1介導的自噬導致A20的缺失會誘發NLRP3炎癥小體在體內和體外過度激活，但這是在神經細胞及骨髓來源的巨噬細胞中研究發現的結果，難愈創面相關細胞的情況是否相同還有待進一步研究。PINK1-NLRP3通路與各類疾病相關聯的證據近些年正逐步積累：PINK1介導的自噬通路能夠有效降低mtROS及NLRP3炎癥小體活化，以緩解或防治肝缺血-再灌注損傷［65］、致命的多微生物敗血癥［66］、急性胰腺炎［67］、神經炎癥［64］、造影劑誘導的急性腎損傷［53］等涉及身體各個系統的損傷。以上說明PINK1介導的自噬對NLRP3炎癥小體的抑制對人體炎癥相關疾病存在重要且廣泛的保護作用，但其與糖尿病難愈創面關系的相關研究尚且較少。

5.2 PINK1在創面修復增生期的作用 創面修復時，糖尿病患者體內的代謝應激狀態會引發細胞線粒體功能異常［68］。研究顯示，高糖微環境中的AGEs對人主動脈內皮細胞中的線粒體動力學有顯著影響，通過促進融合和裂變動態平衡向裂變轉化，顯著增加線粒體裂變和細胞凋亡［69］。內皮細胞狀態異常導致的血管增生障礙是創面修復增生過程受阻的重要原因。研究發現，PINK1在肥胖及糖尿病小鼠中表達上調，并對保護內皮細胞免受損傷有重要作用［70］，這也許是PINK1促進難愈創面肉芽組織增生的作用機制之一，在糖尿病心血管疾病的研究中常有涉及。YANG等［71］發現匹伐他汀可以通過激活PINK1途徑保護內皮祖細胞增殖。XI等［72］提出黃芩素可以通過上調PINK1介導的線粒體自噬，保護人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）免受氧化損傷。另一方面，ZHANG等［73］則認為利拉魯肽（一種胰高血糖素樣肽-1受體激動劑）是通過抑制PINK1介導的線粒體自噬來防止高糖誘導的HUVECs功能障礙。XIANG等［74］也提出沙爾維諾酸B通過下調內皮細胞的凋亡和線粒體自噬來緩解糖尿病內皮和線粒體功能障礙。為何通過上調或抑制自噬都能夠提高內皮細胞的存活率？通過對比得出，損傷來源于高血糖導致的氧化損傷，PINK1介導線粒體自噬清除過量的mtROS是為了減少細胞凋亡，但當ROS過多，自噬功能失調，細胞的凋亡率提高。而當調節因子可直接降低ROS含量，PINK1的表達就會隨之降低。即自噬下調的前提是ROS的降低，自噬行為的減少為跟隨效應。因此這些研究的觀點并非相悖，相反其均肯定了PINK1介導的自噬對于維持線粒體穩態、避免內皮細胞凋亡的保護作用。對此，FAN等［75］提出PINK1途徑可能是氧化銅納米顆粒誘發的病理性血管內皮損傷的治療策略。

5.3 PINK1在創面修復重塑期的作用 在創面修復的最后階段，成纖維細胞和角質形成細胞發揮主要作用，二者之間的相互影響在愈合過程中起重要作用。研究顯示，PINK1表達缺失的患者皮膚中的成纖維細胞更容易發生由應激引發的細胞凋亡，并且過表達組細胞中線粒體上的PINK1在應激條件下會被重新分配到細胞質，證實了PINK1發揮的細胞保護作用［76］。角質形成細胞中的自噬可通過調節CCL2表達激活成纖維細胞和角質形成細胞，促進創面再上皮化并促進創面愈合的進展［77］。自噬影響肌成纖維細胞分化并調節ECM降解，在調節組織重塑中起重要作用［78］。因此，PINK1可能通過調控線粒體自噬發揮重要作用。

6 間充質干細胞（MSCs）在創面修復中的應用

糖尿病難愈創面的治療方式一直在不斷進步和發展，近年來，MSCs治療逐漸步入人們的視野。作為一種重要的多功能自我更新細胞，MSCs分泌細胞因子、免疫調節、分化等能力使其在治療糖尿病難愈創面有著巨大的潛力。MSCs對糖尿病血管疾病的治療與PINK1介導的自噬密切相關。ZHU等［79］發現隨高糖處理的劑量升高和作用時間延長，PINK1和Parkin蛋白、自噬標志物LC3-Ⅱ蛋白表達量降低，促凋亡因子Bax和裂解的Caspase-3蛋白表達量升高，隨后mtROS的產生增加，說明高糖刺激會導致線粒體功能障礙，減少線粒體自噬，促進細胞凋亡。MSCs治療逆轉了這些改變，并且PINK1的上調抑制了Drp1的表達，減少線粒體裂變誘導的碎片化，這可能是降低mtROS的重要途徑。

7 小結與展望

PINK1介導的線粒體自噬在糖尿病難愈創面修復過程中發揮重要作用。PINK1通過調節自噬修復AGEs誘發的線粒體功能障礙，去除產生的過量的ROS以及損傷的DNA，對抗氧化應激，維持細胞的正常功能保護參與創面修復的細胞免受氧化應激損傷。PINK1參與調節炎性因子激活和炎癥信號傳導，抑制炎性反應的持續激活，其還能保護血管內皮細胞免受高糖微環境引起的氧化損傷，促進新生血管的生成、健康肉芽組織的形成。在創面修復的重塑期，PINK1參與調節膠原生成，維持細胞間的信號傳導，促進成纖維細胞和角質形成細胞的增殖和遷移，加速創面修復。遺憾的是，本文總結的關于PINK1調控創面修復的機制均來源于體外實驗。目前仍缺乏PINK1調控糖尿病難愈創面修復的體內研究；并且現有研究未能揭示創面修復的不同階段PINK1參與的分子機制與信號轉導過程的時序性和交互作用。因此，通過體內研究進一步揭示PINK1在創面修復的具體作用機制，對研發治療糖尿病創面的有效措施具有重要意義。

作者貢獻：楊嘉琪進行文章的構思與設計、文獻 /資料收集及整理、論文撰寫及修訂；張培華負責文章的質量控制及審校，對文章監督管理；黃海麗負責論文最終版的修訂，對論文負責。所有作者確認了論文終稿。

本文無利益沖突。