桑樹內生菌的生物活性及應用前景

張錦錦，孫雨婷，郭燁，高文惠，韓俊華*，高林森*

（1.河北科技大學食品與生物學院，河北 石家莊 050018；2.河北省農林科學院農業信息與經濟研究所，河北 石家莊 050051）

植物內生菌是指生活于健康宿主植物組織或器官內 部，不會對宿主植物引起明顯病害的一類微生物群，包括真菌、細菌和放線菌[1]。自1993 年Stierle 等[2]首次從短葉紅豆杉中分離到1 株能產生抗癌活性成分——紫杉醇的內生真菌以來，內生菌逐漸成為許多學科研究的熱點，在農業、食品、醫藥領域展現出重要的開發價值和廣闊的應用前景[3]。對內生菌進行研究，不僅能豐富緊缺藥用資源材料，還能促進物種保護和可持續發展。

桑（Morus alba L.）為桑科桑屬落葉喬木或灌木，屬溫帶和亞熱帶植物，原產并廣泛種植于中國中部和北部地區，是集食用、藥用、飼用、觀賞等于一體的生態經濟型樹種。桑樹全身都是寶，上至桑枝、桑葉，下至桑蠶、沙僵蠶等，均具有巨大的藥用價值。研究發現，桑葉含有豐富的蛋白質、氨基酸、多糖等，具有降脂、降血壓、減肥等功效；桑葚含有花色苷、多酚類、微量元素等，具有抗氧化、抗癌、養顏美容等作用；桑枝含有鞣質、蔗糖、果糖以及豐富的纖維素、半纖維素等，具有清熱、祛風、通經絡等作用；桑白皮具有止咳平喘、利尿和降壓的作用，并能治療風濕麻木、糖尿病等癥狀；桑樹中還含有豐富的黃酮類化合物、植物甾醇、有機酸等[4]。此外，桑樹的生物堿含量較高，尤其是具有顯著降血糖作用的1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）。桑內生菌在整個生命周期內都生活在桑樹體內，與桑樹形成互利共生的關系。桑樹的各個組織器官在我們日常生活中發揮著重要作用，與其內生菌的作用密不可分[5]。

1 桑樹內生菌的多樣性

植物內生菌資源豐富、種類繁多，大部分植物體內含有多種內生菌。同一品種植物，不同季節、不同年齡、不同組織部位，其內生菌的種類也存在一定差異[6]。鄭麗屏[7]從桑樹根、莖、葉中共分離得到132 株內生菌，其中真菌106 株、細菌23 株、放線菌3 株，包括鐮孢霉屬、鏈格孢屬、刺盤孢屬等數十個屬。Luk?a 等[8]從白桑上分離出近百種內生菌，其中，細菌種群以Tatumella（塔特姆氏菌屬）、明串珠菌屬、Frateuria（弗拉德氏菌屬）和假單胞菌屬為主，真菌以Hanseniaspora（有孢漢生酵母屬）、隱球菌屬、枝孢菌屬和Phoma（莖點霉屬）為優勢菌屬。

內生菌的分離多采用組織分離法，消毒時選擇不同濃度的乙醇、NaClO、HgCl 等溶液，通過對植物表面進行不同時間的浸泡，達到去除表面微生物的目的[9]。目前，內生菌的分離方法通常采用常規的分離培養，然而由于生長條件的限制，導致許多不可被常規培養的內生菌[10]被忽略。吳燕燕等[11]分別利用傳統分離培養法和基于Illumina MiSeq 的高通量測序技術分析了桑樹內生細菌的多樣性，結果顯示，通過高通量測序得到的菌群數量遠遠高于傳統組織分離培養法，采用傳統分離培養法會有大量不可培養的內生菌被忽略。Ting 等[12]也采用基于Illumina 的測序方法，對不同品種、不同季節的桑樹內生細菌分布情況進行了研究，結果表明，不同品種的桑樹，春季內生菌主要為變形桿菌門和放線菌門，秋季內生菌以變形桿菌門為主，核心菌屬超過20 種，其中Pantoea（泛菌屬）、Methylobaterium（甲基桿菌屬）和Pseudomonas（假單胞菌屬）的豐富度較高。近年來，從桑樹不同部位分離到了許多種類的內生菌（表1）。

表1 桑樹內生菌的種類Table 1 Species of endophytes in Mulberry

2 桑樹內生菌的生物活性

內生菌為植物菌群的重要組成部分，已從多種植物中分離得到，其中一些菌種已在植物保護領域顯示出巨大的應用潛力，如加速種子萌發、促進植物生長、提高肥料利用率等[33，34]。內生菌在與宿主植物和諧共生過程中產生的活性物質也是抗菌、降血糖、抗氧化等食品或藥品開發的重要潛在資源。

2.1 抑菌活性

因病原菌導致的桑樹病害大約有150 種，其中近30 種病害會對桑樹造成嚴重生長發育不良、桑果產量低、桑果品質劣變等問題，如桑疫病、桑炭疽病、桑葚菌核病等。目前，桑樹病害防控主要是利用化學藥劑，但長期使用化學藥劑會導致農藥殘留、抗藥性等問題越來越凸顯。研究表明，藥用植物內生菌在某種程度上具有一定的抑菌活性[35]。近年來，利用內生菌進行生物防治已逐漸成為備受關注的植物防治新策略，展現出廣泛的應用前景。

王若琳等[23]從桑樹莖中分離到17 株內生細菌，并從中篩選出1 株對桑斷枝爛葉病菌Boeremia exigua GXH1 具有顯著拮抗作用的菌株——貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），該菌株對核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）等其他11 種病原菌具有不同程度的抑制作用，該研究為桑葉病害的生物防治提供了安全和有效途徑。謝潔等[22]從健康的桑莖中分離得到1 株對桑葚核地杖菌具有顯著拮抗作用的內生菌——特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis），該菌株的發酵液對桑葚核地杖菌的抑菌率高達100%，田間試驗結果表明該菌株是開發桑葚菌核病生防制劑的理想菌株。桑樹是蠶桑產業的重要物質基礎，也是我國傳統的藥用植物，但目前桑樹病害嚴重，因此尋找安全無害的治理方法是非常必要的。

2.2 產α-葡萄糖苷酶抑制劑

α-葡萄糖苷酶抑制劑是目前治療Ⅱ型糖尿病的常用藥物，已廣泛應用于糖尿病的治療。DNJ 是一種有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑，具有顯著的降血糖作用。1976 年Yagi[36]首次從桑根皮中分離到天然DNJ，之后又在桑枝、桑葉以及其他植物中陸續發現。目前，桑枝、桑葉作為中藥治療糖尿病，已在我國臨床上應用。

有研究報道，大多數藥用植物內生菌能夠產生與其宿主植物相同或相似的生物活性物質[37]。桑樹是DNJ 含量很高的植物之一[32]，因此，從桑樹中篩選能夠產α-葡萄糖苷酶抑制劑的內生菌受到廣泛關注。但截至目前，從桑樹內生菌中篩選出產α-葡萄糖苷酶抑制劑的菌株報道尚不多見。武婷婷等[25]從桑樹的內生菌中篩選得到1 株產α-葡萄糖苷酶抑制劑的菌株S-J-X-4，初步判定為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）。葉晶晶[32]從桑樹中分離得到2 株高產DNJ的內生菌——嗜麥芽寡養假單胞桿菌和藤黃微球菌，2 個菌株的發酵液提取物對α-葡萄糖苷酶均具有很好的抑制作用，且其中1 個菌株的發酵產物與DNJ 在降低糖尿病小鼠血糖和改善糖尿病癥狀方面表現出相同的效果[38]。鄭麗屏等[13]從桑枝中分離得到1 株產α-葡萄糖苷酶抑制劑的內生真菌SZ-2，經鑒定為鏈格孢屬（Alternaria sp.），其菌絲多糖具有顯著抑制α-葡萄糖苷酶的作用，有望成為新型的α-葡萄糖苷酶抑制劑。在該研究中，其還進一步探究了內生菌SZ-2 菌絲多糖的生物活性，發現內生菌次生代謝產物的生物活性與宿主植物次生代謝產物的生物活性一致。賈亞楠等[17]從桑枝中分離到內生假單胞菌，其代謝產物對α-葡萄糖苷酶也表現出一定的抑制作用，該研究也為利用桑樹內生菌發酵生產天然降血糖藥物提供了理論依據。駱麗如等[18]進一步對從桑樹枝葉中分離得到的內生真菌及其利用桑葉粉末產生DNJ 的效果進行了研究，初步認為，該內生真菌在PDA 培養基中自身不能產生DNJ，但能將桑葉中的某些物質轉化成DNJ，進而增加DNJ 含量。后續研究可以繼續探討桑樹內生菌與DNJ 積累的關系，以明確桑樹內生菌與桑葉組織或懸浮細胞共同培養是否可以提高內生菌的DNJ產量。目前國內外市場對DNJ的需求均處于供不應求的狀態，上述研究也為提高DNJ 含量提供了新的研究思路和依據。

目前，國內外已有許多研究報道了利用微生物合成α-葡萄糖苷酶抑制劑的方法[39～41]，但是利用桑樹內生菌產α-葡萄糖苷酶抑制劑并用于臨床治療高血糖的方法仍有待深入研究，需要綜合考慮菌株的安全性、DNJ 產率和提取成本等。

2.3 調節植物生長

植物內生菌對宿主植物的促生長作用主要表現在對植物種子萌發和生根生長的促進，對植物本身不造成損傷，且對環境友好。研究表明，部分植物內生細菌可以通過產生植物激素[42]、生物固氮作用、光合作用、合成鐵載體[43，44]等，促進植物對氮、磷、鉀、鐵等礦物質的吸收，以及改善土壤微環境等方式促進植物生長。

Xu 等[24]從33 株桑內生拮抗菌中篩選出8 株內生細菌，并進行盆栽試驗，結果表明，8 株供試內生菌對桑樹幼苗生長均具有不同程度的促進作用。其中，1.0×107CFU/mL 芽孢桿菌菌液處理的桑樹幼苗，芽長和根鮮重分別較未處理提高了83.37%和217.70%，表現出顯著的促生長作用。從桑葉中獲得的內生細菌洋蔥伯克霍爾德Lu10-1 能夠產生生長素，有助于磷的溶解和固氮酶活性的提高，能在桑樹幼苗中快速、高效繁殖和傳播，是一種高效的桑樹幼苗生長促進劑[45]。從健康桑樹莖中分離到的1 株內生芽孢桿菌sp.7PJ-16，通過合成吲哚-3-乙酸以及鐵載體，表現出很強的促進植物生長的能力[46]。從健康桑樹根中分離出的內生凝集泛菌SWg2 也能顯著促進桑樹幼苗生長，采用107CFU/mL 的SWg2 菌懸浮液浸種后，桑樹種子發芽率和胚根長度分別提高了100%和144.2%[47]。高繪菊等先后從桑樹中分離出內生細菌——枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[9]和內生真菌——Macrophomina phaseolina[48]，其中一定濃度的枯草芽孢桿菌培養液能顯著提高玉米和桑樹種子的發芽率，明顯增加植株鮮重，對2 種植物幼苗生長均具有明顯的促進作用。可以看出，從桑葉、莖、根等不同部位分離到的內生菌，均對植株生長具有一定的促進作用。目前，我國市場上鮮有植物內生菌的生長促進劑，植物生長調節劑也多為仿制國外產品，品種較少且缺乏創新性。因此，開發新型、更安全、環保的植物生長促進劑和調節劑，將是一個新的契機和挑戰。

2.4 抗氧化活性

桑樹內生菌不僅在抑菌、促生長和降血糖方面倍受關注，其抗氧化能力也不容忽視。鄭麗屏[7]研究報道，桑內生真菌產生的胞外多糖可以顯著抑制乳酸脫氫酶活性，并維持過氧化物酶和過氧化氫酶活性，在降低細胞膜脂質過氧化和過氧化氫損傷方面表現出積極作用。賈亞楠等[17]也發現，桑內生假單胞菌的發酵液具有很強的清除ABTS 自由基和DPPH 自由基的活性。而柴建萍等[49]早在2009 年就已經從3 種桑樹品種中分離得到了可以產黃酮類物質的內生真菌，其發酵培養液中黃酮類物質含量為0.01 mg/mL 左右。因此，內生菌生長過程中產生的多糖及黃酮類物質很可能是其抗氧化活性的主要原因。而且，已有羅漢果內生菌[50]、銀杏內生菌[51]、五味子內生菌[52]、人參內生菌[53]、黃精內生菌[54]生長代謝中產胞外多糖、黃酮類化合物以及清除自由基、提高抗氧化能力的報道。內生菌抗氧化物質的產生與內生菌的特殊生境有關。對內生菌抗氧化活性以及產生的多糖類和黃酮類物質進行深入研究，將為開發新型保健食品或藥品等提供研究基礎和思路。

2.5 產油脂類物質

竇學娥等[48]從桑樹根系中分離到1 株內生真菌Macrophomina phaseolina，該菌株的菌絲及菌核內均可累積大量油脂類物質，且可以利用纖維素生長，營養要求簡單。該菌株菌體含油量高，易于純化，且單不飽和脂肪酸含量較高。這對微生物油脂的產業化開發及應用具有重要意義，并且該菌株的纖維素降解能力也為進一步利用微生物轉化秸稈生產油脂奠定了堅實基礎。在核桃內生細菌和馬尾松內生真菌中均發現了油脂類代謝產物，這也是內生菌與宿主長期共生、相互影響的結果。

3 桑樹內生菌的應用前景

國內外研究均顯示，桑樹內生菌作為一種新型微生物資源具有很高的研究和應用價值，在環境、食品和醫藥等領域具有潛在的應用前景，預計未來的研究及開發應用將主要圍繞以下2 個方面進行：

3.1 桑樹病害防治及果蔬采后保鮮劑開發

桑樹在生長過程中會受到多種真菌、細菌等病原微生物的侵染而引發病害，嚴重病害不僅威脅林業的可持續發展，也給蠶業、桑果產業造成巨大的經濟損失。目前，對桑樹病害的防控主要采取施用化學農藥和種植抗性品種的方法。然而，與之相關的問題是抗藥性增加、農藥殘留、環境污染、抗性品種選育周期長等，且產品性質也很難完全滿足實際生產的需要。因此，尋找新的安全環保的生物防治方法來預防和控制桑樹病害迫在眉睫。

近年來，桑樹內生菌的研究多集中在內生菌的分離和拮抗菌的篩選上，拮抗內生菌的菌群數量不斷擴大，多種內生菌對桑樹致病菌表現出顯著的抑制效果，如桑樹內生細菌B.tequilensis 7PJ-16 對桑葚核地杖菌[22]、B.velezensis NPJ13 對桑斷枝爛葉病菌表現出顯著的拮抗作用[5]。但目前大量研究更多的是停留在針對內生菌發酵液粗提物質的活性分析上，缺乏對具體有效成分的提純、結構鑒定、作用機理等深入探討。未來研究應在篩選有益內生菌的基礎上，探討內生菌及其產生的抑菌物質的結構與特性、使用方式、安全性等，將內生菌應用于開發生物農藥或生物保鮮劑中，使其真正應用于桑樹病害防治以及果蔬的采后保鮮中。

3.2 DNJ 發酵生產及降糖藥物開發

桑樹為重要的中藥材，含有多種活性成分，對桑樹內生菌代謝產物進行深入研究可能為新藥的研究和開發帶來新契機。桑葉為降血糖藥物的新來源，其產降血糖物質DNJ 的研究仍然是目前關注的熱點。然而，目前已報道的從桑樹中篩選出的產DNJ 的內生菌還不適用于食品和醫藥中[32]。因此，桑樹內生菌在開發天然降糖藥物方面的研究還需要進一步深入，如內生菌安全菌株的篩選、內生菌對DNJ 生物轉化的機制、產DNJ 的發酵培養基及發酵條件優化、DNJ 的高效提取技術等，這些工作的深入開展將為實現微生物法生產DNJ 提供堅實可靠的理論基礎。

4 展望

桑樹為藥食同源樹種，其內生菌資源豐富，對于食用、藥用等資源的開發是一個擁有巨大潛力的寶庫。目前，桑樹內生菌抗菌活性、產DNJ 的有關研究均表明其開發潛力巨大，但對其內生菌的研究還處于探索階段，多限于對桑內生菌的分離鑒定以及對致病菌拮抗作用的研究，還存在內生菌資源利用不足、研究領域有限、研究方法單一、具體作用機制（生物轉化途徑、與宿主的相互關系等）尚不明確等問題。桑內生菌作為生物防治、果蔬采后保鮮、抗氧化以及降糖藥物開發的重要潛在用途尚需要進一步探究，未來還應重視內生菌安全性及其與宿主之間關系和作用機理的研究。

隨著現代研究技術的不斷發展，在內生菌研究中新研究工具和手段的應用，將提升內生菌研究的整體水平，如利用高通量測序技術與傳統培養分離相結合，充分挖掘桑樹內生菌資源；通過內生菌的全基因組測序、代謝組及轉錄組研究，準確鑒定相關代謝通路的基因或關鍵酶，為桑樹內生菌資源開發和利用提供基因信息。深入和系統研究內生菌，將會為內生菌的應用帶來新的契機，也會為桑蠶經濟、食品安全以及人類健康等創造更大的利益。