基于生物信息學(xué)分析胰島素分泌細胞誘導(dǎo)過程中miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

王 濤，侯潤博，潘 鑫

(錦州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)療學(xué)院醫(yī)學(xué)系1，醫(yī)學(xué)技術(shù)系2，遼寧 錦州 121013)

Ⅰ型糖尿病作為一種慢性疾病主要是由胰島β細胞受損引起，胰腺或胰島移植可以徹底根治，但是由于供體缺乏以及免疫排斥大大限制該治療方案的臨床應(yīng)用[1，2]，干細胞分化為胰島素分泌細胞（insulinproducing cells，IPCs）再行移植，有望成為Ⅰ型糖尿病治療的新策略[3，4]。miRNA 作為一類小的非編碼RNA，其長度大約在22 個核苷酸左右，能夠與靶mRNA 3’端非翻譯區(qū)互補，進而降解或阻止該mRNA 翻譯出蛋白質(zhì)，實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達調(diào)控[5，6]。生物信息學(xué)通過整合多個學(xué)科領(lǐng)域信息和知識，能夠整體層面揭示疾病或生物過程的復(fù)雜分子機制[7]，而且其通過對已有實驗數(shù)據(jù)的分析，能夠減少重復(fù)實驗所帶來的資源浪費。GEO 數(shù)據(jù)庫是生物信息學(xué)研究重要的中心資源之一，其存儲大量高通量數(shù)據(jù)，但是大部分數(shù)據(jù)并未被充分利用[8]。目前，運用生物信息學(xué)分析干細胞向IPCs 誘導(dǎo)分化過程中miRNA-mRNA 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)報道較少見。因此，本研究運用生物信息學(xué)方法分析干細胞向IPCs 誘導(dǎo)分化過程中的mRNA 表達譜，并構(gòu)建miRNAmRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 通過NCBI 的GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）檢索人胚胎干細胞（human embryonic stem cells，hESCs）向IPCs 誘導(dǎo)分化過程中mRNA 表達譜的相關(guān)數(shù)據(jù)，最終只有GSE42094 數(shù)據(jù)集符合要求，該數(shù)據(jù)集基于GPL10558 平臺，包含23 個樣本數(shù)據(jù)（GSM1032319-41），涉及未分化hESCs（WA09）、IPCs 分化的5 個時期、胰腺內(nèi)胰島和胎胰。

1.2 數(shù)據(jù)處理與差異表達分析 選擇GSE42094 數(shù)據(jù)集內(nèi)的未分化hESCs 和IPCs 分化的5 個時期進行研究，進入“Analyze with GEO2R”項目，點擊“Define groups”設(shè)定分組，其中，hESCs 組包含3 個樣本，Diff1 組3 個，Diff2 組3 個，Diff3 組2 個，Diff4 組2個，IPCs 組3 個，對6 組數(shù)據(jù)進行差異表達分析，篩選標準設(shè)定為adj.P＜0.05。

1.3 GO 功能和KEGG 路徑顯著性分析 為分析差異表達基因的潛在生物學(xué)功能，選用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）數(shù)據(jù)庫進行功能富集分析，主要分析GO 功能以及KEGG 路徑2 個方面，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 為分析差異表達基因的相互作用及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，選用STRING（https://stringdb.org/）數(shù)據(jù)庫進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI 分析，選擇Homo sapiens 作為“Organism”的條件，其余參數(shù)均為系統(tǒng)默認設(shè)置。

1.5 miRNA 預(yù)測 針對差異表達基因預(yù)測其靶miRNA，選用miRTarBase（https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/）數(shù)據(jù)庫，選擇reporter assay、western blot、qPCR 和microarray 四種實驗驗證的miRNA-mRNA 靶向匹配作為預(yù)測miRNA 的入選標準，并應(yīng)用Cytoscape 9.1.0 軟件對miRNA-mRNA 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行可視化。

1.6 預(yù)測miRNA 的驗證 將預(yù)測的miRNA 與PMID:20 735 361[9]的Table S4 數(shù)據(jù)取交集進行驗證，該研究主要分析miRNA 在人胚胎T3 干細胞向胰腺胰島樣細胞團分化過程中的表達，其Table S4 結(jié)果顯示出胚胎T3 干細胞（hES-T3 cells grown on mouse embryonic fibroblast feeder，T3ES）、胚胎內(nèi)胚層（embryoid bodies differentiated from T3 cells，T3EB）和胰腺胰島樣細胞團（pancreatic islet-like cell clusters derived from T3 cells，T3pi）三組標準化的miRNA 表達量。

2 結(jié)果

2.1 差異表達基因 通過對GSE42094 的6 組樣本數(shù)據(jù)分析，差異表達基因的前250 個被顯示，除去沒有名稱和重復(fù)的基因，共得到188 個。進一步對hESCs和IPCs 兩組數(shù)據(jù)分析得到差異表達基因，并與上述188 個基因取交集后，選取誘導(dǎo)后上調(diào)和下調(diào)的各前10 個差異表達基因進行后續(xù)研究，見表1。該20個基因代表整個hESCs 向IPCs 誘導(dǎo)過程中表達量差異最具有統(tǒng)計學(xué)意義的基因。

表1 誘導(dǎo)后上調(diào)和下調(diào)的前10 個差異表達基因

2.2 GO 功能和KEGG 路徑顯著性分析 通過對誘導(dǎo)后上調(diào)和下調(diào)的各前10 個差異表達基因進行GO 功能和KEGG 路徑顯著性分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因在“外泌體”和“胞外”比較集中，主要涉及“谷胱甘肽代謝”和“PPAR 信號通路”，而下調(diào)基因在“基因表達調(diào)控”“內(nèi)胚層的決定”以及“成體干細胞種群維持”比較集中。

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 通過PPI 分析發(fā)現(xiàn)10 個上調(diào)基因中有6 個基因所表達的蛋白質(zhì)具有相互作用，有2 個基因顯示二者間直接作用（GSTA1 和GSTA2），剩余兩個沒有關(guān)聯(lián)（圖1A）。而下調(diào)的10 個基因中LOC729860 和UCA1 在STRING 數(shù)據(jù)庫中沒有收錄，其余8 個基因中有5 個表達的蛋白質(zhì)具有相互作用，剩余3 個沒有關(guān)聯(lián)（圖1B）。將上調(diào)和下調(diào)的基因進行融合分析，發(fā)現(xiàn)下調(diào)基因KLKB1 能夠與上調(diào)基因FGG 直接進行蛋白相互作用，且上調(diào)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)通過VTN 與下調(diào)基因網(wǎng)絡(luò)的POU5F1 直接作用，將兩個網(wǎng)絡(luò)相關(guān)聯(lián)（圖1C）。

圖1 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

2.4 miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 通過miRTarBase 數(shù)據(jù)庫查找靶向作用于差異表達基因的miRNA，選擇reporter assay、western blot、qPCR 和microarray 4 種實驗驗證的miRNA-mRNA 靶向匹配作為預(yù)測miRNA 的入選標準，發(fā) 現(xiàn) CDH17、APOA2、FAM162B、GSTA2、LOC729860、UTF1、KLKB1 等7個基因沒有對應(yīng)miRNA 調(diào)控，而APOA1、TTR、PPP1R16B、RPL36A 4 個基因雖有相應(yīng)miRNA 調(diào)控，但不滿足設(shè)定的入選標準，因此，該11 個基因在應(yīng)用Cytoscape 9.1.0 軟件進行miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可視化過程中，未有miRNA 呈現(xiàn)，其余9 個基因共對應(yīng)23 個預(yù)測的miRNA。其中，DNMT3B 基因顯示有10 個miRNA 調(diào)控其表達，NANOG 基因有9個，而SPINK1 和UCA1 基因僅各有1 個miRNA調(diào)控其表達，且該2 個基因與miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)沒有直接關(guān)聯(lián)。進一步分析發(fā)現(xiàn)miR-335-5p能夠調(diào)控VTN、NANOG、POU5F1 和DNMT3B 4 個基因的表達（圖2），其中VTN 為上調(diào)基因（圖3A），NANOG、POU5F1 和DNMT3B 為下調(diào)基因（圖3B～圖3D）。

圖2 miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

圖3 GEO2R 所示基因的表達量

2.5 預(yù)測miRNA 的驗證 將預(yù)測的miRNA 與PMID:20 735 361 的Table S4 數(shù)據(jù)取交集，得到21 個驗證的miRNA，剩余2 個預(yù)測的miRNA（miR-200b-3p和miR-144-3p）未被驗證，可見絕大部分預(yù)測的miRNA 得到驗證，亦即存在于干細胞及其誘導(dǎo)分化的過程中（表2），同時表明基于4 種實驗預(yù)測miRNA 的方法具備一定的可信度。表2 顯示miR-302a-3p、miR-34a-5p、miR-34c-5p、miR-29b-3p、miR-375 和miR-29a-3p 表達量誘導(dǎo)分化后顯著降低，而miR-134-5p、miR-335-5p 和miR-26a-5p 表達量隨著誘導(dǎo)分化進程逐漸升高，其中miR-335-5p表達量的逐漸升高與NANOG、POU5F1 和DNMT3B表達量的逐漸降低（圖3B～圖3D）形成對照，提示二者之間存在靶向關(guān)系且為負性調(diào)控。結(jié)合圖2 進一步分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因與下調(diào)基因網(wǎng)絡(luò)通過多個miRNA 相關(guān)聯(lián)，其中上調(diào)基因VTN 通過miR-26b-5p和miR-335-5p 與下調(diào)基因網(wǎng)絡(luò)多個基因關(guān)聯(lián)，并且VTN 通過miR-26b-5p 與GSTA1 和GSTA2 的二者間直接作用相關(guān)聯(lián)。上調(diào)基因FGG 通過miR-29家族（miR-29a-3p、29b-3p、29c-3p）與下調(diào)基因DNMT3B 相關(guān)聯(lián)，提示miRNA 通過靶向不同表達類型的基因進而調(diào)控干細胞的誘導(dǎo)分化進程。

表2 PMID:20 735 361 數(shù)據(jù)驗證預(yù)測的miRNA

表2 （續(xù)）

2.6 miR-335-5p 的結(jié)構(gòu)和功能信息 運用miRBase數(shù)據(jù)庫（https://www.mirbase.org/）檢索miR-335-5p的結(jié)構(gòu)信息，其前體hsa-mir-335 的序列及其莖環(huán)結(jié)構(gòu)如圖4A 所示，標紅部分為成熟miR-335-5p 的序列（16-UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU-38）。進一步檢索發(fā)現(xiàn)前體hsa-mir-335 在169 篇文獻中被提及，共涉及864 個詞句，其詞匯云如圖4B 所示，可見其在癌癥和腫瘤方向研究最廣泛，其次就是誘導(dǎo)和分化等方向，與本研究的方向相符。

圖4 miR-335-5p 的結(jié)構(gòu)和功能信息

3 討論

本研究為分析hESCs 向IPCs 誘導(dǎo)分化過程中的mRNA 表達譜，采用生物信息學(xué)方法篩選GEO數(shù)據(jù)庫內(nèi)的數(shù)據(jù)集得到GSE42094，該數(shù)據(jù)集包含未分化hESCs、IPCs 分化的5 個時期、胰腺內(nèi)胰島和胎胰等樣本數(shù)據(jù)。本研究選擇與研究目的直接相關(guān)的未分化hESCs 和IPCs 分化的5 個時期來研究，通過數(shù)據(jù)庫自帶軟件GEO2R 對數(shù)據(jù)進行分析，得出差異表達的mRNA 共188 個，分別選取誘導(dǎo)后上調(diào)和下調(diào)的各前10 個差異表達基因作為后續(xù)研究。

通過GO 功能和KEGG 路徑顯著性分析，發(fā)現(xiàn)下調(diào)基因多涉及基因表達調(diào)控以及多能干細胞調(diào)控信號通路等與干細胞誘導(dǎo)分化機制相關(guān)的內(nèi)容，而上調(diào)基因涉及內(nèi)容則比較寬泛。進一步分析差異表達基因的相互作用，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與下調(diào)基因網(wǎng)絡(luò)通過上調(diào)基因VTN 和下調(diào)基因POU5F1 的直接作用而相關(guān)聯(lián)，提示VTN 和POU5F1 基因可能為該蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的核心基因。玻連蛋白（Vitronectin，VTN）是一種細胞外基質(zhì)糖蛋白，屬于整合素家族成員之一，其在傷口愈合和凝血過程中起著重要作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)其參與多種生物學(xué)過程包括細胞粘附和遷移[10-12]，也能夠通過JNK 和ERK 信號通路誘導(dǎo)INS-1 細胞的增殖[13]。本研究發(fā)現(xiàn)玻連蛋白在Diff3 組表達量開始升高，在IPCs 組達到峰值，表明其參與干細胞的誘導(dǎo)分化過程。POU5F1 又稱OCT4，是一種維持干細胞多能性的轉(zhuǎn)錄因子[14，15]，其與NANOG 在胚胎早期發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，并可作為胚胎干細胞的標志物以及干性維持[16，17]。本研究發(fā)現(xiàn)hESCs 組POU5F1 表達量最高，隨著誘導(dǎo)進程逐漸下降，在Diff3 組表達量就已經(jīng)處于較低水平。

構(gòu)建miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)miR-335-5p能夠調(diào)控VTN、NANOG、POU5F1 和DNMT3B 基因的表達，其中VTN 為上調(diào)基因，NANOG、POU5F1 和DNMT3B 為下調(diào)基因。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病模型GK 大鼠的胰島內(nèi)miR-335-5p 表達量顯著增高，其能夠直接靶向抑制Stxbp1 mRNA 的表達，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-335-5p 在INS-1 832/13 細胞內(nèi)的過表達能夠抑制葡萄糖刺激的胰島素分泌[18]。Tang XW 等[19]發(fā)現(xiàn)在妊娠期糖尿病小鼠中過表達miR-335-5p 能夠抑制VASH1 的表達進而降低胰島素釋放的水平，并通過激活TGF-β 信號通路誘發(fā)胰島素抵抗。最近，Li G 等[20]研究發(fā)現(xiàn)miR-335-5p 能夠下調(diào)SLC2A4 基因表達進而抑制胰腺細胞的生長，與二型糖尿病的進展密切相關(guān)。但是，miR-335-5p是否參與干細胞誘導(dǎo)分化為IPCs 未見報道。

通過將預(yù)測的miRNA 與文獻PMID:20 735 361數(shù)據(jù)取交集，得到18 個驗證的miRNA，miR-335-5p包含其中，結(jié)果顯示miR-335-5p 在內(nèi)胚層階段（T3EB）其表達量升高2 倍多，至胰腺胰島樣細胞團階段（T3pi）升高接近5 倍，可見其在整個干細胞及其誘導(dǎo)分化過程中均有表達，且隨著誘導(dǎo)分化進程逐漸升高，表明miR-335-5p 不但參與糖尿病的發(fā)生進展，而且參與干細胞誘導(dǎo)分化為IPCs 的整個過程。

綜上所述，本研究共篩選得到差異表達的基因188 個，分別選取誘導(dǎo)后上調(diào)和下調(diào)的各前10 個進行分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)通過VTN 與下調(diào)基因網(wǎng)絡(luò)的POU5F1 直接作用，將兩個網(wǎng)絡(luò)相關(guān)聯(lián)。miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)miR-335-5p 能夠調(diào)控VTN、NANOG、POU5F1 和DNMT3B 4 個基因的表達，進一步驗證發(fā)現(xiàn)miR-335-5p 表達量隨著誘導(dǎo)分化進程逐漸升高，與NANOG、POU5F1 和DNMT3B 表達量逐漸降低形成對照，提示二者之間存在靶向關(guān)系且為負性調(diào)控。因此，該miRNAmRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示miR-335-5p 靶向多個基因參與hESCs 向IPCs 誘導(dǎo)分化過程。