富血小板纖維蛋白中生長(zhǎng)因子含量及釋放周期的實(shí)驗(yàn)研究

林盤玉 許 放 趙良軍

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，廣西南寧 530021

富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是第二代血小板濃縮物，含有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3（transforming growth factor-β3，TGF-β3）、血小板源生長(zhǎng)因子-AA（platelet-derived growth factor-AA，PDGF-AA）和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin-like growth factor，IGF-1）等多種生長(zhǎng)因子，當(dāng)機(jī)體組織出現(xiàn)損傷后，血小板被激活并釋放生長(zhǎng)因子，在組織創(chuàng)面愈合、血管生成及成軟骨分化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。PRF在凝血酶的作用下形成非溶性纖維蛋白，纖維蛋白進(jìn)而促進(jìn)血小板聚集，隨著時(shí)間的推移，纖維蛋白在一定時(shí)期內(nèi)被逐步降解，血小板分批被激活，能有效提高生長(zhǎng)因子釋放和利用效率[2]。目前相關(guān)研究主要集中于觀察富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）的短期效應(yīng)，并沒(méi)有充分觀察整個(gè)釋放時(shí)間段和釋放趨勢(shì)[3]，有必要深入研究PRP及PRF中生長(zhǎng)因子釋放量與釋放時(shí)間的關(guān)聯(lián)性及影響因素，有助于擴(kuò)大臨床應(yīng)用范圍和深度。本研究通過(guò)對(duì)比PRP與PRF中TGF-β3、PDGF-AA和IGF-1生長(zhǎng)因子含量及釋放周期，探討PRF的臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

1 資料與方法

1.1 分組

課題組招募10名健康志愿者，簽署試驗(yàn)知情同意書，本研究資料的收集符合醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的規(guī)定。在雙側(cè)肘靜脈抽取2管血液，每管各5 ml，按隨機(jī)數(shù)表法將左右兩側(cè)2管靜脈血分為PRP組和PRF組，在相同條件下制備成PRP和PRF檢測(cè)樣本，備用。

1.2 ELISA法測(cè)定PRF中TGF-β3、PDGF-AA和IGF-1濃度

1.2.1 制備培養(yǎng)液 ①?gòu)?0名健康志愿者雙側(cè)肘靜脈各獲取5 ml血液；②置入普通離心機(jī)內(nèi)離心，制備PRP和PRF；③收集EP管內(nèi)液體并記錄樣本量，-80℃冰箱留存，標(biāo)本溶液待測(cè)。

1.2.2 測(cè)定PRF中TGF-β3、PDGF-AA及IGF-1濃度 ①樣品準(zhǔn)備：將EP管取出并融化，設(shè)置離心參數(shù)為2000 r/min，離心20 min，取上清液；②標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備：用1 ml的稀釋溶液將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到標(biāo)準(zhǔn)濃度，緩慢搖晃10 min，將原液稀釋至10 ng/ml，然后在倍數(shù)比下稀釋成以下濃度：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6 pg/ml，標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液作為0 pg/ml；③按照TGF-β3、PDGF-AA、IGF-1試劑盒（美國(guó)Sigma公司，美國(guó)，批號(hào)：BJ-E687473）進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣本OD值濃度曲線。

1.3 PRF顯微結(jié)構(gòu)

使用JCM-7000掃描電子顯微鏡（日本Olympus株式會(huì)社，型號(hào)：JCM-7000）觀察PRF的顯微結(jié)構(gòu)。①將離心好的PRF標(biāo)本置入含有2.5%戊二醛溶液的容器內(nèi)，固定24 h，依次用PBS緩沖液反復(fù)沖洗標(biāo)本，各3次，每次5 min；②將標(biāo)本用25%、50%、75%、90%、100%不同濃度乙醇依次進(jìn)行脫水，不同梯度每次15 min；③將標(biāo)本用20 nm金離子濺射進(jìn)行包裹鍍膜，于金屬拖上將標(biāo)本進(jìn)行粘連，并做好標(biāo)記；④設(shè)置15 kV、8000×放大倍數(shù)等相關(guān)參數(shù)，應(yīng)用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察，采集PRF標(biāo)本上、中、下3段的圖像；⑤對(duì)PRF標(biāo)本圖像進(jìn)行分析，并描述顯微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Pearson分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRP和PRF中TGF-β3、PDGF-AA和IGF-1的釋放總量比較

PRP與PRF中TGF-β3、PDGF-AA、IGF-1的釋放總量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見表1。

表1 PRP和PRF中TGF-β3、PDGF-AA和IGF-1的釋放總量比較（ng/ml，）

表1 PRP和PRF中TGF-β3、PDGF-AA和IGF-1的釋放總量比較（ng/ml，）

注 TGF-β3：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3；PDGF-AA：血小板源生長(zhǎng)因子-AA；IGF-1：和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1；PRF：富血小板纖維蛋白；PRP：富血小板血漿

組別 TGF-β3 PDGF-AA IGF-1 PRP 組 385.3±36.8 113.8±17.4 102.4±12.5 PRF 組 401.8±43.4 128.5±19.1 109.8±14.7 t值 0.92 1.79 1.21 P值 0.37 0.08 0.24

2.2 PRP和PRF中生長(zhǎng)因子釋放周期情況

兩組生長(zhǎng)因子含量中TGF-β3最高，IGF-1次之，PDGF-AA最少；PRP中生長(zhǎng)因子3 d內(nèi)達(dá)到釋放高峰，1周內(nèi)緩慢釋放；PRF中生長(zhǎng)因子在1周內(nèi)出現(xiàn)釋放高峰，3周后釋放趨于平穩(wěn)，不同生長(zhǎng)因子的釋放高峰出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)不同。

2.3 PRF結(jié)構(gòu)

PRF呈淡黃色膠凍狀，質(zhì)地均勻，富有彈性，去除下層的紅細(xì)胞碎塊，雙面加壓后PRF呈膜片狀物質(zhì)，質(zhì)地堅(jiān)韌，主體部分呈淡黃色，下段少量紅色（圖1A～B）；電鏡掃描結(jié)果顯示：PRF中膠原纖維束形態(tài)規(guī)則、結(jié)構(gòu)清晰、表面光滑，纖維束之間相互交聯(lián)纏繞，呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含血小板、白細(xì)胞和紅細(xì)胞細(xì)胞等成分（圖1C～D）。

3 討論

血液主要由紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和血漿等多種成分組成，其中紅細(xì)胞約占44%，白細(xì)胞及血小板約占1%，通過(guò)設(shè)置不同離心參數(shù)，可制備出不同狀態(tài)和結(jié)構(gòu)成分的血小板濃縮物，包括PRP、PRF和生長(zhǎng)因子濃縮物（concentrated growth factors，CGF），PRF是第二代血小板濃縮物，通過(guò)離心形成非纖溶性纖維蛋白，隨著纖維蛋白逐步降解，滯納于纖維蛋白內(nèi)的血小板及白細(xì)胞逐漸被激活，進(jìn)而釋放生長(zhǎng)因子[4-5]。

PRP和PRF中TGF-β3、PDGF-AA和IGF-1的釋放曲線相似，釋放總量一致，不同生長(zhǎng)因子的釋放高峰點(diǎn)及持續(xù)時(shí)間不同。PRF中3種生長(zhǎng)因子釋放總量對(duì)比，TGF-β3最高，IGF-1次之，PDGF-AA最少；生長(zhǎng)因子在1周內(nèi)出現(xiàn)釋放高峰，隨后逐漸下降，3周后釋放趨于平穩(wěn)；He等[6]研究發(fā)現(xiàn)PRF在2周內(nèi)生長(zhǎng)因子釋放達(dá)到高峰，4周后釋放趨于平穩(wěn)，認(rèn)為生長(zhǎng)因子釋放曲線具有一定的時(shí)間周期性，與本研究結(jié)果類似。本實(shí)驗(yàn)掃描電鏡結(jié)果顯示膠原纖維束呈網(wǎng)狀交叉排列，直徑1～2 μm、表面光滑，結(jié)構(gòu)清晰、密度均勻、形態(tài)規(guī)則，內(nèi)含大量細(xì)胞成分[7]。PRF橫截面顯示三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)表面膠原纖維束密度及直徑更大，中間更為疏松，纖維束間隙更大[8-9]，這種特殊構(gòu)型可能是離心過(guò)程中纖維蛋白與離心管壁碰撞引起的，四周致密及中間疏松多孔可以容納更多的小分子物質(zhì)，聚集的血小板沿著纖維束之間呈歸巢式排列[10-11]，血小板與生長(zhǎng)因子通過(guò)化學(xué)鍵的方式聚集成塊，表面致密的膠原纖維可以延緩血小板團(tuán)塊逃逸，隨著纖維蛋白逐步降解，血小板被激活，從而延緩生長(zhǎng)因子釋放，特殊的三維網(wǎng)狀構(gòu)型是其發(fā)揮生物學(xué)作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[12-13]。

PRF生長(zhǎng)因子釋放量及釋放曲線受多種因素影響，生長(zhǎng)因子主要來(lái)源于纖維蛋白、血小板、白細(xì)胞及其他成分，通過(guò)降低離心速度和縮短離心時(shí)間可以增加生長(zhǎng)因子釋放量，可能與包含更多未激活的白細(xì)胞有關(guān)，離心參數(shù)改變會(huì)引起網(wǎng)狀構(gòu)型變化，從而影響滯納小分子物質(zhì)的能力，其次，離心管類型也會(huì)影響血小板含量及分布[14]；Kobayashi等[15]發(fā)現(xiàn)不同個(gè)體間血液成分也存在一定差異性，同樣離心條件下PRF生長(zhǎng)因子含量也不同，認(rèn)為生長(zhǎng)因子釋放量受體內(nèi)外多種因素影響。

綜上所述，PRP和PRF能有效釋放生長(zhǎng)因子，且釋放總量較為一致，但是由于PRF中纖維蛋白逐漸被降解，進(jìn)而延長(zhǎng)了生長(zhǎng)因子的釋放時(shí)間，其釋放曲線具有一定的時(shí)間周期性。