星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對左氧氟沙星泊洛沙姆407/188眼用凝膠的制備工藝優(yōu)化

黃 騫 張培雯▲ 代 晶 樊蓮蓮 蘇文成 李林峻 曹 飛

1.四川省德陽市人民醫(yī)院Ⅰ期臨床研究中心，四川德陽 618000；2.成都醫(yī)學(xué)院，四川成都 610500

眼內(nèi)炎是白內(nèi)障術(shù)后感染最嚴(yán)重的并發(fā)癥，若發(fā)現(xiàn)和治療不及時(shí)可導(dǎo)致視力喪失[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，眼內(nèi)炎的病原體是通過穿透的手術(shù)切口帶入眼內(nèi)的[3]。左氧氟沙星為全合成氟喹諾酮抗菌藥，對眼內(nèi)炎感染的常見菌群具有良好抑菌效果[4]。近年來，利用原位凝膠的液-固相轉(zhuǎn)變能力[5]，已有諸多左氧氟沙星眼用凝膠的研究報(bào)道。通常采用均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)或正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，精度與預(yù)測性較低，難以實(shí)現(xiàn)處方放大生產(chǎn)。因此，本研究擬采用非線性擬合的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對左氧氟沙星泊洛沙姆溫敏型原位凝膠的處方工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（予華儀器有限公司）；NDJ-5S型數(shù)字式粘度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；數(shù)顯水浴恒溫震蕩器（常州莆田儀器制造有限公司）；LC-2030C Plus型高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.2 藥物與試劑

鹽酸左氧氟沙星（批號：2010R005073，上虞京新藥業(yè)有限公司，含量：99.4%）；泊洛沙姆407（P407）（批號：GNC06921B，德國 BASF）；泊洛沙姆 188（P188）（批號：GNC10821B，德國 BASF）；鹽酸左氧氟沙星對照品（批號：130455-201607，中國食品藥品檢定研究院）；其他試劑均為分析純。

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1 凝膠基質(zhì)制備及膠凝溫度測定 稱取P407和P188粉末適量，加入低溫純化水，緩慢攪拌，置于4℃冰箱中充分溶脹，即得。取凝膠溶液置于西林瓶中，放入水浴鍋中緩慢升溫，每升高0.5℃觀察一次膠凝情況，以膠團(tuán)不流動時(shí)的溫度即為膠凝溫度。

1.3.2 凝膠基質(zhì)對膠凝溫度的影響 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用單因素法考察P188與P407濃度對膠凝溫度的影響。設(shè)定P188濃度為2%，P407濃度分別為 20%、22.5%、25%、27.5%、30%；設(shè)定 P407濃度為25%，P188濃度分別為0%、2%、4%、6%、8%。

1.3.3 人工淚液稀釋前后膠凝溫度測定 凝膠溶液與人工淚液按體積比按40∶7的比例混合，考察混合前后的膠凝溫度，模擬凝膠進(jìn)入眼內(nèi)的相變過程。

1.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化處方

1.4.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì) 參考前期研究數(shù)據(jù)[6]，左氧氟沙星對膠凝溫度的影響很小。因此，選擇對膠凝溫度有顯著影響的P407濃度（X1，%，w/v）和P188濃度（X2，%，w/v）為考察因素，極值范圍：X1為20%～30%、X2為0%～8%，以模擬淚液稀釋前后的膠凝溫度T1、T2為考察指標(biāo)，進(jìn)行兩因素五水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)。

1.4.2 模型擬合及數(shù)據(jù)分析 采用Design-Expert V8.0.6軟件，以膠凝溫度T1、T2為指標(biāo)，對兩個(gè)因素進(jìn)行多元線性回歸。根據(jù)最佳擬合模型，繪制三維效應(yīng)面圖和二維等高線圖，并通過疊加的等高線圖獲取優(yōu)選處方范圍。計(jì)算實(shí)測值與預(yù)測值的差異，驗(yàn)證模型擬合的準(zhǔn)確性。

1.5 體外溶蝕與釋放實(shí)驗(yàn)

1.5.1 色譜條件及方法學(xué)考察 色譜條件：色譜柱Chromplus C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相磷酸二氫鉀緩沖液（pH=2.2）∶乙腈=85∶15；流速1 ml/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μl；檢測波長294 nm。

精密稱定鹽酸左氧氟沙星對照品25 mg，加0.1 mol/L鹽酸溶液定容至100 ml，即得250 μg/ml的左氧氟沙星對照液。分別精密量取1、2、3、4、5 ml對照液，加0.1 mol/L鹽酸溶液定容至10 ml，考察左氧氟沙星在25～125 μg/ml濃度范圍內(nèi)的線性。

1.5.2 體外累積溶蝕量與釋放度測定 采用無膜溶出法考察左氧氟沙星凝膠的體外溶蝕與釋放行為[7]。精密量取4 ml左氧氟沙星凝膠溶液于預(yù)稱重的試管中，34℃下充分膠凝，加入等溫人工淚液1.5 ml，頻率為100 r/min，于各時(shí)間點(diǎn)取樣1.5 ml，并補(bǔ)充等量、等溫淚液。樣品經(jīng)稀釋、過濾后，取濾液進(jìn)樣測定濃度，并計(jì)算累積溶蝕百分率和累積釋放百分率。

2 結(jié)果

2.1 P407與P188對膠凝溫度的影響

圖1、2結(jié)果表明，P407和P188與膠凝溫度之間具有濃度依賴性。固定P407的濃度，膠凝溫度隨P188的濃度升高而增加，而膠凝溫度與P188濃度呈正相關(guān)。進(jìn)一步模擬凝膠在生理環(huán)境下的相變情況，凝膠溶液與人工淚液混合后膠凝溫度下降，表明淚液會影響凝膠的形成。

圖1 P407濃度對膠凝溫度的影響

圖2 P188濃度對膠凝溫度的影響

2.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法

2.2.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì) 根據(jù)表1的因素水平安排實(shí)驗(yàn)，星點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表2。分析數(shù)據(jù)后，得出最佳擬合模型為二次多項(xiàng)擬合，方程結(jié)果：T1=104.13-5.25X1+4.41X2-0.1X1X2+0.08X12-0.031X22（R2=0.9904，P＜ 0.01），T2=153.4-7.59X1+2.87X2+0.012X1X2+0.104X12-0.16X22（R2=0.9900，P＜ 0.01）。由擬合方程的擬合優(yōu)度R2及P值可知，T1和T2兩種模型的擬合效果良好。模型方差分析結(jié)果顯示，P407和P188對淚液稀釋前后的膠凝溫度均有顯著影響。見表3～4。

表1 因素水平表

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面設(shè)計(jì)安排與結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果（T1）

表4 方差分析結(jié)果（T2）

2.2.2 效應(yīng)面優(yōu)化和估測 星點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)果的三維效應(yīng)面圖和等高線圖見圖3～4；將T1、T2的等高線疊加，利用模型選擇模擬T1≥25℃、T2≤34℃的交集區(qū)域，獲得凝膠處方優(yōu)化數(shù)學(xué)模型的最佳區(qū)域（兩條等高線之間的區(qū)域），結(jié)果見圖5。

圖3 P407和P188對膠凝溫度影響的三維效應(yīng)面圖

圖4 P407和P188對膠凝溫度影響的等高線圖

圖5 處方優(yōu)化的二維等高線疊加圖

2.2.3 處方驗(yàn)證 模型擬合獲得優(yōu)化處方配比：P407濃度為25.23%，P188濃度為1.89%。結(jié)果驗(yàn)證實(shí)測值為33.0℃，與預(yù)測值（36.0℃）相對偏差為2.9%（＜5%），表明預(yù)測效果良好。

2.3 體外溶蝕與釋放實(shí)驗(yàn)

2.3.1 方法學(xué)結(jié)果 圖6顯示，對照溶液和左氧氟沙星凝膠溶液保留時(shí)間基本一致，凝膠基質(zhì)無干擾，方法專屬性良好。左氧氟沙星在25～125 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為Y=52969X+16783，r=0.9998。計(jì)算得到，日內(nèi)峰面積RSD為0.013%，日間RSD為0.052%；平均回收率為（93.95±1.42）%（RSD=1.51%）。

圖6 色譜圖

2.3.2 載藥凝膠體外溶蝕與釋放結(jié)果 如圖7所示，凝膠的累積溶蝕百分率和累積釋放百分率隨時(shí)間不斷增加，且同一時(shí)間點(diǎn)累積溶蝕百分率大于累積釋放百分率。采用無膜溶出法能更好地模擬眼部眨眼、淚液稀釋等因素對制劑的影響[7]，本研究中淚液溶蝕是影響藥物釋放的主要因素。

圖7 載藥凝膠體外溶蝕與釋放曲線

3 討論

左氧氟沙星是氧氟沙星的左旋異構(gòu)體，分子結(jié)構(gòu)中含有親水性的羧基和噁嗪環(huán)，以及疏水性的N-甲基哌嗪[8]。泊洛沙姆是一類由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯（PEO-PPO-PEO）組成的兩親性共聚物[9]，P407和P188作為其中研究較多的兩類材料，利用二者分子量與PEO/PPO比例不同的特點(diǎn)[10-11]，按照一定比例混合可獲得具有反向可逆膠凝性質(zhì)的溫敏凝膠[12]。本研究發(fā)現(xiàn)P407和P188的濃度以及淚液環(huán)境均會影響膠凝溫度，目前常規(guī)的均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)與正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是基于線性模型的設(shè)計(jì)，通常采用單一因素的取值方向，難以擬合多因素混合的模型[6]。因此，本研究采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法，通過描繪效應(yīng)（膠凝溫度）對考察因素（P407和P188的濃度）的效應(yīng)面，從效應(yīng)面上選擇目的效應(yīng)區(qū)，預(yù)測模擬淚液環(huán)境下的膠凝基質(zhì)取值范圍即優(yōu)選處方，其精確度高、預(yù)測性好。

研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)膜囊、瞼緣、睫毛根部及瞼板腺導(dǎo)管均存在大量定植菌群分布，這些細(xì)菌在手術(shù)刺激下可成為條件致病菌，進(jìn)入眼內(nèi)誘發(fā)感染[13-14]。目前白內(nèi)障術(shù)前預(yù)防感染的主要方式為滴眼液和沖洗消毒，藥物在眼部滯留時(shí)間短、易受淚液稀釋，僅能減少結(jié)膜囊及眼表細(xì)菌。眼瞼作為內(nèi)眼手術(shù)的必經(jīng)途徑，手術(shù)操作中不斷擠壓必然會使殘留在瞼板腺內(nèi)定植菌排出到結(jié)膜囊內(nèi)，由于眼瞼特殊的解剖結(jié)構(gòu)，常規(guī)術(shù)前清潔消毒難以有效清除內(nèi)部細(xì)菌[15]。左氧氟沙星對瞼緣內(nèi)主要菌群（如凝固酶陰性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌）有良好的抑菌效果[16]，該藥物尚未研制成合適的眼用制劑用于眼瞼緣處的感染防治。因此，本研究制備的左氧氟沙星原位凝膠具有較理想的處方配比及較平緩的釋藥行為，有望成為極具潛力的產(chǎn)品。