lncRNA NEAT1調節miR-15a-5p/HOXD10軸對子癇前期滋養細胞增殖、凋亡和侵襲的影響

聶桂蘭，范徐妃，王春茶，于輝蘭，范俊霞

lncRNA NEAT1調節miR-15a-5p/HOXD10軸對子癇前期滋養細胞增殖、凋亡和侵襲的影響

聶桂蘭1，范徐妃2，王春茶1，于輝蘭1，范俊霞1

1.金華市婦幼保健院產科，浙江金華 321000；2.金華市中心醫院產科，浙江金華 321000

探討長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）核富集轉錄本1（nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1）對子癇前期（preeclampsia，PE）滋養細胞增殖、凋亡和侵襲的影響及分子機制。體外培養人絨毛膜滋養細胞HTR-8/Svneo，分為正常對照（NC）組、si-NC組、si-NEAT1組、si-NEAT1+anti-NC組和si-NEAT1+anti- miR-15a-5p組。采用四甲基偶氮唑藍法、流式細胞術和Transwell小室實驗檢測細胞增殖活性、凋亡和侵襲能力；實時定量聚合酶鏈反應檢測細胞中NEAT1、miR-15a-5p和同源盒基因D10（homeobox D10，HOXD10）mRNA表達；蛋白質印跡法檢測細胞中HOXD10和上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關蛋白[鈣黏蛋白E（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和神經鈣黏素（N-cadherin）]的表達；雙熒光素酶報告基因和RNA結合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）實驗驗證HTR-8/Svneo細胞中NEAT1、miR-15a-5p和HOXD10的調控機制。敲減NEAT1可顯著促進HTR-8/Svneo細胞增殖、侵襲和EMT，抑制細胞凋亡，并上調miR-15a-5p表達，抑制HOXD10的mRNA和蛋白表達（<0.05）；下調miR-15a-5p的表達可明顯逆轉NEAT1敲減對滋養細胞增殖、凋亡和侵襲的影響（<0.05）。雙熒光素酶和RIP實驗證實NEAT1可靶向結合并負調控HTR-8/Svneo細胞中的miR-15a-5p，且HOXD10是miR-15a-5p的靶標。敲減NEAT1可通過上調miR-15a-5p抑制HOXD10表達，進而促進滋養細胞的增殖和侵襲，并抑制滋養細胞的凋亡。

子癇前期；長鏈非編碼RNA；核富集轉錄本1；微RNA-15a-5p；同源盒基因D10；滋養細胞

子癇前期（preeclampsia，PE）是一種以高血壓、蛋白尿為主要特征的妊娠疾病，發生在妊娠20周后，是導致孕產婦和新生兒死亡的主要原因之一[1]。絨毛外滋養細胞異常的細胞侵襲能力是PE發生發展的重要因素[2]，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在PE中發揮重要作用[3-4]，核富集轉錄本1（nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1）是lncRNA家族的活躍成員。據報道，NEAT1參與調控宮頸癌、乳腺癌和前列腺癌的發生和進展[5-7]。研究顯示，NEAT1在PE中上調，并可能通過抑制滋養細胞的增殖、遷移和侵襲促進PE發展[8]。lncRNA可通過充當微RNA（microRNA，miRNA）海綿參與基因調控，微RNA-15a-5p（microRNA- 15a-5p，miR-15a-5p）可抑制子宮內膜癌和肺癌的發展[9-10]。有研究發現miR-15a-5p在PE中下調，上調其表達可誘導滋養細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[11]。生物信息學分析顯示，miR-15a-5p為NEAT1的潛在靶點，同源盒基因D10（homeobox D10，HOXD10）mRNA序列含有miR-15a-5p的結合位點。在PE中，HOXD10呈高表達，敲減HOXD10可促進滋養細胞的增殖、侵襲和EMT[12]，表明HOXD10可能是PE中miR-15a-5p的潛在靶標。以上研究提示NEAT1/ miR-15a-5p/HOXD10軸可能調節PE中滋養細胞的增殖、凋亡和侵襲。因此，本研究以人絨毛膜滋養細胞HTR-8/Svneo為研究對象，分析NEAT1/miR- 15a-5p/HOXD10軸與滋養細胞生物學活性的關聯及該軸在PE發展中的調控網絡。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人絨毛膜滋養細胞系HTR-8/Svneo購自美國典型培養物保藏中心（ATCC）；小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）陰性對照（si-NC）和NEAT1 siRNA（si-NEAT1）、miR-15a-5p mimic、miR-15a-5p inhibitor及其陰性對照（miR-NC、inhibitor-NC）購自廣州Ribobio公司；四甲基偶氮唑藍（methylthiazolyltetrazolium，MTT）細胞增殖/毒性檢測試劑盒、膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；Magna RIP? RNA結合蛋白免疫沉淀試劑盒購自美國Millipore公司；兔源一抗HOXD10、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）購自英國Abcam公司；鈣黏蛋白E（E- cadherin）、波形蛋白（vimentin）、神經鈣黏素（N- cadherin）購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養 將HTR-8/Svneo細胞接種在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養基中，培養條件：37℃，5% CO2。

1.2.2 細胞轉染 將HTR-8/SVneo細胞以1×105個細胞/孔的密度接種在6孔板上，生長并匯合到60%～70%。使用Lipofectamine? 3000轉染試劑將si-NEAT1、miR-15a-5p inhibitor和si-NC、inhibitor-NC分別轉染到HTR-8/SVneo細胞中，實驗分為正常對照組（NC組，未轉染）、si-NC組（轉染si-NC）、si-NEAT1組（轉染si-NEAT1）、si-NEAT1+anti-NC組（si-NEAT1與inhibitor-NC共轉染）、si-NEAT1+ anti-miR-15a-5p組（si-NEAT1與miR-15a-5p inhibitor共轉染）。轉染6h，然后在37℃和5% CO2的培養箱中放置48h。隨后收集細胞，實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測細胞中NEAT1、miR-15a-5p和HOXD10 mRNA的表達水平，并采用蛋白質印跡法檢測細胞中HOXD10蛋白表達，驗證轉染效果，并繼續進行后續實驗。

1.2.3 細胞增殖活性檢測 轉染后，將HTR-8/Svneo細胞以5×103個細胞/孔接種到96孔板中，分別培養24、48和72h。隨后，向每孔中加入20μl 5mg/ml的MTT溶液，并在培養箱中培養4h。之后加入150 μl二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），振搖15min。最后，使用酶標儀檢測570nm處各孔的光密度（optical density，OD）。

1.2.4 細胞凋亡檢測 用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌轉染的細胞并離心，向細胞中加入500μl結合緩沖液重懸細胞并將濃度調整為4×105個細胞/ml；隨后加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI，將細胞在黑暗中孵育30min。流式細胞儀檢測細胞凋亡，激發波長488nm，FITC檢測波長530nm，PI檢測波長575nm。

1.2.5 細胞侵襲實驗 Transwell小室在37℃下用基質凝膠包被30min，將轉染48h后的各組HTR-8/ Svneo細胞重懸于無血清培養基中。然后將200μl待測細胞懸液（1×104個細胞）置于上室，將含有10% FBS的600μl培養基放入下室。孵育48h后，取出Transwell小室，PBS沖洗3次，濕棉簽小心擦除上室底部膜表面的細胞，侵入膜下表面的細胞用4%多聚甲醛固定并用0.1%結晶紫染色。使用光學顯微鏡對5個隨機選擇的視野中的染色細胞進行計數，取平均值。

1.2.6 qRT-PCR 用TRizol試劑提取細胞的總RNA，隨后測定RNA濃度和純度，并通過逆轉錄試劑盒制備cDNA。在ABI Prism?7500型熒光定量PCR儀上使用SYBR Green Super Mix試劑盒進行qRT-PCR擴增RNA片段，評估NEAT1、miR- 15a-5p和HOXD10 mRNA表達水平。選擇GAPDH和U6作為lncRNA、mRNA和miRNA的內參，采用2-ΔΔCt方法計算靶基因的相對表達量。引物序列見表1。

1.2.7 蛋白質印跡法 收集細胞并使用細胞裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度。將蛋白質（30μg）通過10%聚丙烯-酰氨凝膠電泳分離，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜。室溫下用5%脫脂牛奶封閉1h后，將膜與一抗在4°C下孵育過夜。然后與IgG二抗（1∶5000）在室溫下孵育1h。使用化學發光試劑顯影蛋白質，用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達量。

1.2.8 靶基因預測和雙熒光素酶報告基因檢測 使用StarBase數據庫預測miR-15a-5p與NEAT1和HOXD10之間的結合位點；構建野生型（WT）和突變型（MUT）重組報告質粒（NEAT1-WT、HOXD10-WT、NEAT1-MUT、HOXD10-MUT）。使用Lipofectamine? 3000轉染試劑將NEAT1-WT、NEAT1-MUT或HOXD10-WT、HOXD10-MUT與miR-NC或miR-15a-5p mimic共轉染至HTR-8/Svneo細胞；HTR-8/Svneo細胞（2×105個細胞/孔）在6孔板中培養并在達到60%～70%融合時轉染，轉染48h后，收獲并裂解細胞，使用雙熒光素酶報告分析系統進行熒光素酶測定，并將螢火蟲熒光素酶活性值標準化為海腎熒光素酶活性值。

1.2.9 RNA結合蛋白免疫沉淀測定 使用Magna RIP? RNA結合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）試劑盒驗證NEAT1與miR-15a-5p的結合。具體步驟：HTR-8/Svneo細胞在RIP裂解液中裂解。然后將包含Argonaute-2（Ago2）抗體或IgG抗體（作為陰性對照）的磁珠與細胞裂解物在4°C下孵育6h，提取免疫沉淀RNA，進行qRT-PCR分析NEAT1與miR-15a-5p的富集。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 敲減NEAT1對HTR-8/Svneo細胞增殖的影響

在48h和72h時，si-NEAT1組的OD值較NC組、si-NC組顯著降低（<0.05）；si-NEAT1+anti-miR- 15a-5p組的OD值較si-NEAT1組、si-NEAT1+anti-NC組顯著升高（<0.05），見表2。

2.2 敲減NEAT1對HTR-8/Svneo細胞凋亡和侵襲的影響

si-NEAT1組HTR-8/ Svneo細胞凋亡率較NC組、si-NC組顯著降低，侵襲細胞數顯著增加（<0.05）；si-NEAT1+anti-miR-15a-5p組HTR-8/Svneo細胞凋亡率較si-NEAT1組、si-NEAT1+anti-NC組顯著升高，侵襲細胞數顯著減少（<0.05），見表3。

2.3 敲減NEAT1對HTR-8/Svneo細胞中NEAT1、miR-15a-5p、HOXD10表達水平的影響

與NC組、si-NC組相比，si-NEAT1組HTR-8/ Svneo細胞中NEAT1、HOXD10 mRNA和HOXD10蛋白表達水平顯著降低，miR-15a-5p表達水平顯著升高（<0.05）；與si-NEAT1組、si-NEAT1+anti-NC組相比，si-NEAT1+anti-miR-15a-5p組HTR-8/ Svneo細胞中HOXD10 mRNA和蛋白表達水平顯著升高，miR-15a-5p表達水平顯著降低（<0.05），見表4。

表1 引物序列

表2 各組HTR-8/Svneo細胞OD值比較（）

注：與NC組比較，*<0.05；與si-NC組比較，#<0.05；與si-NEAT1組比較，△<0.05；與si-NEAT1+anti-NC組比較，▲<0.05

表3 各組HTR-8/Svneo細胞凋亡率和侵襲細胞數量比較（）

注：與NC組比較，*<0.05；與si-NC組比較，#<0.05；與si-NEAT1組比較，△<0.05；與si-NEAT1+anti-NC組比較，▲<0.05

2.4 敲減NEAT1對HTR-8/Svneo細胞中EMT相關蛋白表達的影響

與NC組、si-NC組相比，si-NEAT1組E-cadherin蛋白水平顯著降低，N-cadherin、vimentin蛋白水平顯著升高（<0.05）；與si-NEAT1組、si-NEAT1+anti- NC組相比，si-NEAT1+anti-miR-15a-5p組E-cadherin蛋白水平顯著升高，N-cadherin、vimentin蛋白水平顯著降低（<0.05），見表5。

2.5 NEAT1在HTR-8/Svneo細胞中靶向并負調控miR-15a-5p

通過StarBase數據庫預測，miR-15a-5p被確定為NEAT1的潛在靶標，見圖1。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，與NEAT1-WT+miR-NC組相比，NEAT1-WT+miR-15a-5p mimic組細胞的熒光素酶活性顯著降低[（1.02±0.11）（0.35±0.06），<0.05]，與NEAT1-MUT+miR-NC組相比，NEAT1-MUT+miR- 15a-5p mimic組細胞的熒光素酶活性無顯著變化[（0.99±0.10）（1.01±0.09），>0.05]。RIP檢測結果顯示，相對于IgG對照組，NEAT1和miR-15a-5p在Ago2復合物中高度富集，見表6。

2.6 miR-15a-5p負調控HOXD10的表達

使用StarBase數據庫預測miR-15a-5p的靶基因，發現HOXD10的3'UTR具有與miR-15a-5p互補的序列，見圖2。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，與HOXD10-WT+miR-NC組相比，HOXD10-WT+miR- 15a-5p mimic組細胞的熒光素酶活性顯著降低[（1.00±0.11）（0.40±0.06），<0.05]，與HOXD10- MUT+miR-NC組相比，HOXD10-MUT+miR-15a-5p mimic組細胞的熒光素酶活性無顯著變化[（0.98± 0.09）（1.02±0.10），>0.05]。

表4 各組HTR-8/Svneo細胞中NEAT1、miR-15a-5p和HOXD10表達水平比較（）

注：與NC組比較，*<0.05；與si-NC組比較，#<0.05；與si-NEAT1組比較，△<0.05；與si-NEAT1+anti-NC組比較，▲<0.05

表5 各組HTR-8/Svneo細胞中E-cadherin、N-cadherin、vimentin蛋白水平比較（）

注：與NC組比較，*<0.05；與si-NC組比較，#<0.05；與si-NEAT1組比較，△<0.05；與si-NEAT1+anti-NC組比較，▲<0.05

圖1 StarBase數據庫預測的NEAT1和miR-15a-5p的靶向結合序列

表6 RIP檢測結果（）

注：與IgG對照組比較，*<0.05

圖2 StarBase數據庫預測的HOXD10和miR-15a-5p的靶向結合序列

3 討論

絨毛膜滋養細胞浸潤到子宮壁的肌肉層是胎盤發育不可缺少的生理過程。研究表明，PE患者的滋養細胞遷移和侵襲能力明顯下降，導致螺旋動脈重塑不足，這是PE發病的主要驅動因素[13]。lncRNA的異常表達可通過調節細胞過程（如遷移、侵襲）促進PE的發生和進展。

在PE患者胎盤組織中NEAT1表達水平升高[14]；敲減NEAT1表達可促進PE大鼠胎盤滋養細胞的增殖、遷移和侵襲[8]。本研究發現，敲減NEAT1可抑制滋養細胞凋亡，同時增加細胞活力和侵襲能力。EMT是細胞遷移和侵襲所必需的，其特點是低表達的上皮標志物（E-cadherin）和高表達的間充質標志物（N-cadherin和vimentin）[15]。在本研究中，敲減NEAT1可降低E-cadherin表達，升高vimentin和N-cadherin表達，促進滋養細胞的EMT過程。綜合以上結果可知，通過誘導EMT過程，敲減NEAT1可促進滋養細胞增殖和侵襲，并抑制細胞凋亡。這與既往研究結果一致，表明沉默NEAT1可能有助于緩解PE進展。

lncRNA發揮其生物學功能的途徑主要是通過結合miRNA以調節下游靶基因。已發現miR-15a-5p在PE中下調[11]，過表達miR-15a-5p可誘導滋養細胞增殖、遷移、侵襲和EMT。本研究通過生物信息學預測網站發現miR-15a-5p與NEAT1具有互補的結合位點。在HTR-8/Svneo細胞中敲減NEAT1后，miR-15a-5p的表達增加。隨后，雙熒光素酶報告實驗證實miR-15a-5p是NEAT1的靶基因；RIP檢測結果進一步證實NEAT1和miR-15a-5p可在HTR-8/ Svneo細胞中結合。此外，進一步發現下調miR-15a- 5p逆轉NEAT1敲減對滋養細胞增殖、凋亡和侵襲的影響，表明NEAT1可靶向負調控HTR-8/Svneo細胞中的miR-15a-5p。提示NEAT1可能通過與miR- 15a-5p競爭性結合促進PE發展。

HOXD10在調控細胞增殖、凋亡、分化、血管生成及腫瘤細胞侵襲轉移等方面發揮重要作用[16]。HOXD10的表達水平和功能因癌癥類型而異，例如在膠質瘤中HOXD10表達增加[17]，而在子宮內膜癌中HOXD10表達減少[18]。Zhang等[12]研究顯示，HOXD10在PE胎盤中呈高表達，敲減其表達可促進滋養細胞的增殖、侵襲和EMT。本研究使用生物信息學網站預測到miR-15a-5p和HOXD10之間存在結合位點，表明HOXD10是miR-15a-5p的潛在靶標。雙熒光素酶報告實驗進一步證實HOXD10是miR- 15a-5p的靶基因。此外，qRT-PCR證實這一發現，NEAT1敲減可正向調節HOXD10表達，而miR- 15a-5p抑制挽救NEAT1敲減誘導的HOXD10表達減少。提示miR-15a-5p可通過靶向HOXD10抑制細胞凋亡，并促進滋養細胞的增殖和侵襲。

綜上所述，敲減NEAT1可促進滋養細胞增殖和侵襲，并抑制細胞凋亡，其作用機制可能與調節miR-15a-5p/HOXD10軸有關。本研究表明NEAT1是治療PE的潛在靶點，可為PE發病機制的研究提供有效的理論依據。但lncRNA的功能非常復雜，仍需要進一步的體內實驗和機制探索，以深入揭示PE的發病機制。

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Influences of lncRNA NEAT1 on the proliferation, apoptosis and invasion of preeclamptic trophoblast cells by regulating the miR-15a-5p/HOXD10 axis

NIE Guilan, FAN Xufei, WANG Chuncha, YU Huilan, FAN Junxia

1.Department of Obstetrics, Jinhua Maternal & Child Health Care Hospital, Jinhua 321000, Zhejiang, China; 2.Department of Obstetrics, Jinhua Municipal Central Hospital, Jinhua 321000, Zhejiang, China

To investigate the influences and molecular mechanism of long noncoding RNA (lncRNA) nuclear-enriched abundant transcript 1 (NEAT1) on the proliferation, apoptosis and invasion of preeclampsia (PE) trophoblast cells.Human chorionic trophoblast cells HTR-8/Svneo were cultured in vitro and grouped into normal control (NC) group, si-NC group, si-NEAT1 group, si-NEAT1+anti-NC group, and si-NEAT1+anti-miR-15a-5p group. Cell proliferation activity, apoptosis and invasion ability were detected by methylthiazolyltetrazolium (MTT) method, flow cytometry and Transwell chamber assay; quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the expression of NEAT1, miR-15a-5p and homeobox D10 (HOXD10) mRNA in cells; Western blotting was used to detect the expression of HOXD10 and epithelial-mesenchymal transition (EMT)-related proteins (E-cadherin, vimentin and N-cadherin) in cells; the regulatory mechanism of NEAT1, miR-15a-5p and HOXD10 in HTR-8/Svneo cells was verified by dual-luciferase reporter gene and RNA-binding protein immunoprecipitation (RIP) experiments.Knockdown of NEAT1 greatly promoted the proliferation, invasion and EMT of HTR-8/Svneo cells, inhibited cell apoptosis, up-regulated the expression of miR-15a-5p, and inhibited the expression of HOXD10 mRNA and protein (<0.05); down-regulation of miR-15a-5p expression greatly reversed the influences of NEAT1 knockdown on the proliferation, apoptosis and invasion of trophoblast cells (<0.05). Dual-luciferase and RIP experiments confirmed that NEAT1 could target and negatively regulate miR-15a-5p in HTR-8/Svneo cells, and HOXD10 was a target of miR-15a-5p.Knockdown of NEAT1 may inhibit the expression of HOXD10 by up-regulating miR-15a-5p, thereby promoting the proliferation and invasion of trophoblast cells, and inhibiting the apoptosis of trophoblast cells.

Preeclampsia; Long noncoding RNA; Nuclear-enriched transcript 1; MicroRNA-15a-5p; Homeobox D10; Trophoblast cell

R714.25

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.07.003

浙江省基礎公益研究計劃項目（LQ19H040002）

范徐妃，電子信箱：fanx0_08@163.com

（2022–09–07）

（2023–01–31）