構建銅死亡相關LncRNA風險模型預測肝細胞癌的預后及分子特征

王碩 白紅艷 費素娟 苗蓓

摘 要：銅死亡是一種新的程序性細胞死亡途徑，由銅與脂酰化三羧酸循環蛋白直接結合而啟動。調節腫瘤細胞中的銅死亡是一種新的治療方法。然而，銅死亡相關長鏈非編碼RNA（LncRNA）在肝細胞癌（HCC）中的潛在作用和臨床意義尚不明確。本研究基于TCGA-LIHC數據集對19個銅死亡相關基因進行共表達分析，共鑒定出994個銅死亡相關LncRNA。采用LASSO回歸和多因素Cox回歸分析篩選出4個與銅死亡相關的預后LncRNA（TMCC1-AS1、AC009974.2、AL355574.1和DDX11-AS1）構建預后風險模型，并計算所有HCC患者樣本的風險評分。按1：1的比例將肝癌患者分為高風險組和低風險組。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，高風險組患者的總生存率（OS）明顯低于低風險組。回歸分析和ROC曲線證實了風險評分的預后價值。此外，本研究分析了風險評分與通路富集分析、免疫檢查點基因、免疫細胞浸潤、抗癌藥物敏感性和體細胞基因突變之間的相關性。差異表達分析結果表明，TMCC1-AS1、AC009974.2、AL355574.1和DDX11-AS1在腫瘤組織中的表達均升高。最后，利用收集的8例行根治性手術肝癌患者的癌組織及癌旁肝組織進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證，以增加本模型的組織學證據。本研究構建了一個由4種銅死亡相關LncRNA組成的風險模型，該模型與患者的預后及免疫浸潤環境明顯相關，在預測患者免疫治療效果及指導化療藥物選擇方面具有一定的臨床應用價值。

關鍵詞：肝細胞癌；銅死亡；免疫逃逸；腫瘤突變負荷；LncRNA

中圖分類號：R735.7 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.04.006

Construction of a Cuproptosis-related LncRNA Risk Model to Predict the Prognosis and Molecular Characteristics of Hepatocellular Carcinoma

WANG Shuo， BAI Hongyan ， FEI Sujuan， MIAO Bei?

（Department of Gastroenterology， Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University， Xuzhou 221004， China）

Abstract： Cuproptosis is a new programmed cell death pathway， which is initiated by the direct binding of copper to the fatty acyl tricarboxylic acid cycle proteins. Modulation of cuproptosis in tumor cells is a novel therapeutic approach. However， the potential role and clinical significance of cuproptosis-related long non-coding RNA （lncRNA） in hepatocellular carcinoma （HCC） remain unclear. In this study， a total of 994 cuproptosis-related lncRNA were identified by co-expression analysis of 19 cuproptosis-related genes based on the TCGA-LIHC dataset. LASSO regression and multivariate Cox regression analysis were used to screen out four prognostic lncRNA （TMCC1-AS1， AC009974.2， AL355574.1 and DDX11-AS1） related to copper mortality to construct a prognostic risk model， and the risk scores of all HCC patient samples were calculated. HCC patients were divided into high risk and low risk groups at a 1：1 ratio. Kaplan-Meier survival curve analysis showed that the overall survival rate （OS） of the high risk group was significantly lower than that of the low risk group. Regression analysis and ROC curve confirmed the prognostic value of the risk score. In addition， we analyzed the correlation between risk scores and pathway enrichment analysis， immune checkpoint genes， immune cell infiltration， anticancer drug sensitivity， and somatic gene mutations. The results of differential expression analysis showed that TMCC1-AS1， AC009974.2， AL355574.1 and DDX11-AS1 were all up-regulated in tumor tissues， which were verified by real-time fluorescent quantitative PCR （qRT-PCR） in tumor tissues and adjacent liver tissues collected from 8 patients with hepatocellular carcinoma undergoing radical surgery. This give histological evidence for this model. In conclusion， a risk model composed of four cuproptosis-related lncRNA was constructed， which was significantly related to the prognosis and immune infiltration environment of patients. This model has certain clinical application value in predicting the effects of immunotherapy and guiding the selection of chemotherapy drugs.

Key words： hepatocellular carcinoma; cuproptosis; immune escape; tumor mutation burden; LncRNA

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（4）： 330-344）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第五大常見癌癥，發病率呈上升趨勢［1］。中國的新診斷肝癌病例和肝癌相關死亡病例占全球病例的近55%［2］。盡管有手術、肝移植、放療和化療等治療方案，但HCC患者的生存率并不令人滿意，大多數HCC患者被診斷為晚期疾?。?］，因此，迫切需要確定調控HCC生長和進展的新機制，以便發現新的有效的診斷和治療方法來改善生存結局。近年來，越來越多的癌癥患者受益于免疫治療。在HCC患者中，鑒定可靠的預后生物標志物是開發有效治療靶點的可靠策略［4］。

銅死亡是一種新的銅誘導細胞死亡機制，它與其他已知的程序性細胞死亡機制（如凋亡、焦亡、自噬和鐵亡）不同［5］。銅是人體正常生理功能所必需的微量元素。高于閾值的銅水平具有細胞毒性，特別是在腫瘤微環境中［6］。銅誘導的免疫毒性和劑量依賴性細胞周期阻滯與肝細胞死亡發生在小鼠的肝臟中［7］。銅誘導的細胞死亡涉及銅離子與脂?；人嶂芷诘鞍椎慕Y合，可誘導脂?；鞍椎姆e累和Fe-S簇蛋白的丟失，從而誘導蛋白毒性應激和銅死亡［8］。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）作為一種主要的非編碼調控RNA，參與了許多生物過程［9］。LncRNA在細胞核和細胞質中通過多種機制調節基因的表達［10］。多項研究表明，LncRNA可調節多種癌癥的發生、生長和進展，是多種癌癥中很有前景的診斷和預后生物標志物［11-12］。銅死亡相關LncRNA是頭頸部鱗狀細胞癌患者可靠的預后生物標志物［13］，在腫瘤預后和腫瘤免疫應答中的預測價值逐漸成為研究的主要領域。因此，本研究的目的是鑒定出與肝癌患者預后相關的銅死亡相關LncRNA，構建銅死亡相關LncRNA預后模型，并研究預后模型在預測HCC患者預后和免疫治療反應方面的準確性。

1 材料與方法

1.1 TCGA-LIHC 數據集

HCC的基因表達數據（424個樣本）、臨床信息（377個樣本）和體細胞突變數據均來自癌癥基因組圖譜（the cancer genome alias program，TCGA）數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/repository）。首先，對臨床信息不完整的樣本進行分析和排除后，僅納入370例腫瘤樣本的臨床信息進行后續分析。然后，使用GENCODE數據庫（https：//www.gencodegenes.org）注釋LncRNA。最后，從先前發表的一項研究中提取了19個與銅死亡相關的基因［8］。本研究已獲得徐州醫科大學附屬醫院倫理委員會的批準（倫理批號：XYFY2022-KL486-01）。遵照倫理相關規定收集了8例HCC患者（年齡范圍為32～75歲；平均年齡為64歲）的腫瘤組織和匹配的鄰近正常肝組織（距離腫瘤邊緣至少5 cm）。這些患者于2021年9月至2022年6月在徐州醫科大學附屬醫院接受了常規根治性手術。術后立即將所有組織樣品放在液氮中冷凍以進行進一步試驗。

1.2 銅死亡相關LncRNA的鑒定

用R中的“limma”包鑒定銅死亡相關LncRNA。這些LncRNA與19個銅死亡相關基因共表達，這些基因在之前的研究中已被鑒定［8］。閾值參數包括|Cor|>0.4和P<0.001。通過桑基圖和熱圖可視化銅死亡相關基因和銅死亡相關LncRNA的共表達關系。

1.3 基于銅死亡相關LncRNA的預后模型構建

將臨床資料完整的患者樣本隨機分為訓練組（185例）和驗證組（185例），進行單因素Cox回歸分析，以確定訓練組中銅死亡相關的LncRNA與HCC患者的預后相關。隨后，進行最小絕對收縮和選擇算子（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）Cox回歸分析，并進行1 000倍交叉驗證，以進一步篩選候選LncRNA。最后，進行多變量Cox回歸分析，以識別風險基因并計算其風險系數。風險評分模型按以下公式構建：風險評分=TMCC1-AS1×0.813 051 596 972 350+

AC009974.2×（-1.607 526 169 270 300）+

AL355574.1×0.589 827 605 252 249+DDX11-AS1×0.829 692 708 022 306。計算所有樣本的風險評分，然后，基于訓練組中位風險評分將患者分為高風險組和低風險組。采用Kaplan-Meier生存曲線評估風險模型的預后性能。

1.4 銅死亡相關LncRNA預后模型的驗證

用單因素和多因素Cox回歸分析評估預后因素的預測能力，包括風險評分和其他臨床病理特征。使用受試者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線評估風險模型預測HCC患者的總生存期（overall survival，OS）的準確性。用無進展生存期（progression free survival，PFS）分析和C指數分析進一步驗證風險模型的性能。

1.5 免疫檢查點基因分析

為了探究免疫檢查點基因阻斷的治療效果，我們根據TCGA-LIHC基因表達譜獲取關鍵免疫檢查點基因的表達量，包括PDCD1、PD-L1和CTLA-4等，并分析其在不同風險組表達量的差異。

1.6 腫瘤免疫細胞浸潤與免疫應答分析

通過單樣本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）評估所有患者的腫瘤免疫細胞浸潤評分和免疫功能。用熱圖展示免疫功能的差異，用箱式圖展示免疫細胞富集的差異。隨后，利用ESTIMATE計算樣本腫瘤微環境（tumor microenvironmrnt，TME）中免疫細胞和基質細胞的成分，對比高、低風險組間微環境特征的差異。運行腫瘤免疫功能障礙與排斥算法（tumor immune dysfunction and exclusion，TIDE）計算數據集（http：//tide.dfci.harvard.edu）中每個患者的免疫治療評分，展示預后風險評分和免疫反應之間的關系［15］。

1.7 功能富集分析

為了闡明低風險組和高風險組之間富集途徑的差異，采用R編程語言（4.1.3）版本中的clusterProfiler包進行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）。

1.8 風險評分與腫瘤突變負荷（TMB）的關系

使用R包“maftools”計算每位患者基于LIHC樣本突變數據的腫瘤突變負荷（tumor mutational burden，TMB）評分。采用箱式圖分析不同風險組的TMB評分。使用瀑布圖對突變頻率較高的基因進行可視化。

1.9 藥物敏感性評估

使用R包“pRRophetic”進行嶺回歸分析預測所有樣本的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值［18］。用于分析的數據來自腫瘤藥物敏感性基因組學（genomics of drug sensitivity in cancer，GDSC）數據庫（https：//www.cancer-rxgene.org/），這是最大的藥物基因組學數據庫。采用R包“ggplot2”繪制箱式圖，顯示不同風險組的藥敏分布。

1.10 統計分析

使用R編程語言（4.1.3）版進行統計分析。統計檢驗采取雙邊檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。GSEA中符合NES>1、P<0.01及P.adjust<0.05的富集結果為差異具有統計學意義（NES為標準化富集分數，P 為標準化顯著性水平，P.adjust為經過矯正多重假設檢驗的顯著性水平）。PCR試驗中采用兩組配對樣本t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

1.11 逆轉錄定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）

采用SYBR Premix Ex Taq? II試劑盒（Takara生物技術有限公司）進行逆轉錄定量聚合酶鏈反應（reverse transcriptional quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）。使用的引物序列如下：TMCC1-AS1正向為5′-AGCGAGGGATCGAGTTGAGA-3′；TMCC1-AS1反向為5′-TAGTCATGTCCCCGTTGGTG-3′；GAPDH正向為5′-CGACTTACATGGCCTTA-3′；GAPDH反向為5′-TTCCGATCACTGTTGGAAT-3′；AL355574.1正向為5′-TGCTTTCCTCAGGCTCTAAGG-3′；AL355574.1反向為5′-CCTGTCCACCTCGTGTTCTTPCR-3′；DDX11-AS1正向為 5′-CTGGCTACTCTTCCTCCTGG-3′；DDX11-AS1反向為5′-CAGAGGACATGTGGGAGGTT-3′。反應條件如下：95℃持續1 min，40個循環；95℃持續10 s，57℃持續40 s。相對表達水平使用2??ΔΔCq方法，以GAPDH為內源性對照。

2 結果與分析

2.1 在HCC樣本中鑒定994個銅死亡相關LncRNA

使用GENCODE數據庫在TCGA-LIHC表達矩陣中鑒定了16 876個LncRNA。利用Pearson分析鑒定出994個銅死亡相關LncRNA。這些LncRNA與19個銅死亡相關基因相關。圖1中的?；鶊D和熱圖分別顯示了銅死亡相關基因和銅死亡相關LncRNA之間的相關性。本研究從TCGA數據庫中納入了370例具有完整臨床信息的患者。此外，將所有患者隨機分為訓練組和驗證組。HCC患者的臨床資料匯總見表1，兩組臨床指標基本一致，具有可比性。

2.2 肝癌患者銅死亡相關LncRNA預后模型的構建

首先以P<0.05為閾值，基于單變量Cox回歸分析確定了264個銅死亡相關的LncRNA。圖2a中的森林圖顯示了前18個LncRNA的風險比和P值。對264個銅死亡相關LncRNA進行LASSO Cox回歸分析，確定了9個可能與預后相關的LncRNA（圖2b?2c）。隨后，多變量Cox回歸分析確定了4個與預后相關的LncRNA，利用4種預后相關LncRNA建立預后風險模型。風險評分計算公式為：風險評分=（0.813 051 597×Expression TMCC1-AS1）+

（-1.607 526 169×Expression AC009974.2）+

（0.589 827 605×Expression AL355574.1）+（0.829 692 708×Expression DDX11-AS1）。使用訓練組中位風險評分將訓練隊列HCC患者分為高風險組和低風險組。通過Kaplan-Meier生存曲線分析評估高風險組和低風險組HCC患者OS率的差異（圖2d?2f）。如圖2g?2h所示，HCC患者的高風險評分與預后不良相關。利用熱圖顯示高風險組和低風險組中4個模型LncRNA的表達差異（圖2i）。

2.3 銅死亡相關LncRNA預后模型的驗證及預后價值

基于單因素和多因素Cox回歸分析，進一步研究了預后因素的預測能力，包括風險評分、性別、年齡（年齡從16歲到85歲不等）、組織學分級和臨床分期。單因素分析顯示，臨床分期和風險評分可能是評估HCC患者OS的可靠預后因素（圖3a）。多變量分析證實，在對可能的混雜因素進行校正后，在HCC患者的TCGA數據集中，臨床分期和風險評分是OS的獨立預測因素（圖3b）。低風險組HCC患者的PFS明顯長于高風險組（P<0.05，圖3c）。時間依賴性ROC曲線分析結果顯示，1、2和3年OS的預后LncRNA特征的曲線下面積（area under curve，AUC）值分別為0.752、0.708和0.690（圖3d）。C指數和分類ROC曲線分析證實，預后模型比年齡、性別、腫瘤分級、腫瘤分期等其他臨床病理特征更能預測HCC患者的OS（圖3e?3f）。

2.4 免疫檢查點基因分析

在高風險組中，TIGIT、CD40、CD86、CTLA4、LAG3、VSIR、LMTK3、CD80、ICOS、TNFRSF4、SIRPA、TNFRSF9和LILRB4高表達（圖4a）。HLA可分為I類、II類和III類基因區域，一般通過參與細胞表面的抗原呈遞和機體的免疫調節來激活免疫反應。通常認為，HLA中某些分子的高表達與某些人類癌癥的預后不良有關。圖4b表明，HLA-DRA、HLA-DMB、HLA-DOA、HLA-DMA、HLA-DPB1、HLA-DRB6、HLA-DQA2、HLA-DOB、HLA-H、HLA-A和HLA-DQB2在高風險組中的表達明顯高于低風險組。最后，基于CTLA-4和PD-1的表達狀態比較高風險組和低風險組之間的免疫表型，結果顯示，在CTLA-4基因表達陰性的免疫表型中高風險組和低風險組的免疫應答反應具有顯著差異（圖4c）。

2.5 風險模型與HCC患者的腫瘤免疫細胞浸潤

和腫瘤免疫應答密切相關

采用ssGSEA分析評估高風險組和低風險組HCC患者13種免疫相關功能的狀態。如熱圖所示，Type II IFN response、Type I IFN response、cytolytic activity和 MHC class I在高風險組和低風險組之間有顯著的差異（圖5a）。為了進一步了解不同風險組的腫瘤微環境的差異，本研究計算并比較了23種常見浸潤免疫細胞的相對表達，結果表明，活化CD4+T細胞、嗜酸性粒細胞、自然殺傷細胞及單核細胞等在高、低風險組間具有明顯的差異性（圖5b）。腫瘤微環境一般由免疫細胞、腫瘤細胞及間質細胞構成，用TME評分比較不同風險組的基質及免疫活性差異，結果提示，低風險組人群擁有較低的腫瘤純度及較高的間質和評估評分（圖5c～5d）。HCC患者的TIDE評分與免疫治療反應呈負相關［19］。兩個風險組之間的TIDE評分有顯著差異（圖5e）。高風險組HCC患者的TIDE評分明顯低于低風險組。這表明，高風險組患者的免疫治療效果更好。因此，風險評分是HCC患者免疫治療結果的一個有希望的預測指標。

2.6 風險評分與HCC患者的腫瘤突變負荷相關

從TCGA數據庫中提取HCC患者的體細胞突變數據，用于計算HCC樣本的TMB評分，結果顯示，高風險組和低風險組TMB評分有顯著的差異（圖6a）。采用TMB中位數評分將HCC患者分為高TMB組和低TMB組。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，高TMB組患者的OS明顯低于低TMB組（圖6b）。最后，我們分析了不同風險組的前15個高頻基因，用瀑布圖可視化兩組中突變頻率最高的前15個基因，結果顯示，TP53突變的頻率在高風險組最高（圖6c），低風險組CTNNB1突變頻率最高（圖6d）。

2.7 功能富集分析

為了進一步探究高風險組與低風險組患者基因功能富集的差異，運用基因集富集分析方法進行富集分析。結果表明：低風險組中顯著富集的是氧化還原活動和有機酸代謝過程（圖7a?7b）；高風險組中顯著富集的是蛋白水解和肝癌亞型的激增（圖7c?7d）。

2.8 風險模型與HCC患者的抗癌藥物敏感性的關系

使用“pRRophetic”R包評估風險預后模型與抗腫瘤藥物敏感性之間的關系，共鑒定出12種藥物，且其敏感性（IC50）在高風險組和低風險組之間存在顯著的差異（P<0.05）（圖8、圖9），表明這些藥物在未來可能對HCC患者的個性化治療有用。

2.9 TMMCC1-AS1、AL35574.1及DDX11-AS1在HCC中上調

本研究分析了模型LncRNA在肝癌組織及癌旁組織的表達量差異。如圖9a所示，TMMCC1-AS1、AL35574.1及DDX11-AS1均在癌組織中表達上調。利用收集到的肝癌組織進行qRT-PCR組織驗證，結果顯示，肝癌組織中TMMCC1-AS1、AL35574.1及DDX11-AS1的表達水平升高（圖9b～9d）。

3 討論

一些研究報道，免疫治療可顯著提高HCC患者的生存率［20-21］。索拉非尼（sorafenib）可以顯著提高HCC患者的OS，并顯著改善不可切除HCC患者的預后［22］。然而，HCC患者的總體預后仍然不理想，一些不發達國家的生存率低于5%［23］。因此，本研究探討了與銅死亡相關的LncRNA作為生物標志物用于肝癌患者預后預測和治療選擇的有效性和可靠性。

銅死亡不同于其他傳統的細胞死亡機制，是由銅離子誘導的［24］。據報道，銅代謝失調主要見于乳腺癌［25］、肺癌［26］和結直腸癌［27］。此外，銅是一種必需的微量營養元素，與腫瘤的發生、增殖、侵襲和轉移相關［27-28］。LncRNA參與基因表達調控，在腫瘤的發展和轉移中發揮了重要作用［29］。一些LncRNA風險模型已被開發用于預測肝癌［30］、胃癌［31］和乳腺癌［32］的腫瘤結局，指導腫瘤免疫治療。然而，與銅死亡相關的LncRNA在HCC中的預后價值尚未被研究。因此，本研究全面探討了銅死亡相關LncRNA與HCC患者預后及免疫應答的相關性，以期開發有效可靠的標志物，準確預測HCC患者預后，指導選擇適合免疫治療的患者。

根據單因素、多因素和LASSO回歸分析的結果，將TMCC1-AS1、AC009974.2、AL355574.1和DDX11-AS1這4個與銅死亡相關的LncRNA納入預后模型。TMCC1-AS1的高表達與肝癌患者的不良預后相關，在肝癌患者中是一個新的癌基因［33］，且TMCC1-AS1與HCC的預后相關。有研究報道，TMCC1-AS1可促進肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT［33］。AL355574.1是胃癌的預后生物標志物和保護因素［34］。DDX11-AS1可通過調控RWDD4/miR-499b-5p軸在膠質瘤中發揮致癌作用，并且與膠質瘤患者的不良預后相關［35］。AC009974.2在腫瘤中的作用尚未見報道。

隨后，本研究從不同角度驗證了模型的預測精度和穩定性。生存分析顯示，該預后模型能較好地預測HCC患者的預后。通過ROC曲線分析可知，與銅死亡相關的LncRNA模型在預測HCC患者1、3、5年生存率方面具有較好的性能。單因素及多因素回歸分析證明了LncRNA相關風險模型是HCC的獨立預后因素，與其他臨床特征（如年齡、性別、腫瘤分級和腫瘤分期）相比，具有更高的特異性和敏感性。在三陰性乳腺癌患者中，腫瘤組織中銅代謝異常會使內皮細胞比例異常增加。細胞凋亡可通過改變多種免疫細胞的比例干擾肝癌患者的免疫應答。本研究的ssGSEA結果表明，銅死亡相關的預后模型與HCC組織中免疫細胞的富集有關。通過功能富集分析確定了預后模型中不同風險組患者的基因功能富集差異。

最后，本研究觀察到低風險組患者的TMB評分高于高風險組，TP53是高風險HCC患者中最常見的突變基因。不同風險組間的TIDE評分差異有統計學意義，低風險組患者的TIDE評分往往較高。這表明，低風險組的患者可能對免疫治療更敏感。此外，多種抗癌癥藥物的藥物敏感性在高風險組和低風險組間具有明顯的差異，利用PCR技術進一步驗證模型LncRNA在癌組織中表達升高，這為模型在臨床的應用提供了病理組織學證據。利用模型提供的評分系統賦予臨床肝癌患者風險評分，依據TIDE評分、免疫表型、免疫細胞浸潤、藥物敏感性和體細胞基因突變在不同風險組中存在顯著的差異。該模型可以評估化療和免疫靶向治療的臨床療效，為肝癌患者提供更為精確個體化的治療選擇。

然而，本研究也有一些局限性。首先，與銅死亡相關的LncRNA預后模型需要進一步驗證，僅進行了PCR試驗驗證，同時，ACC009974.2中現有研究未提供明確基因序列無法設計引物。其次，風險模型中的LncRNA調控HCC發生發展的具體機制尚不清楚，需要在未來的研究中通過細胞試驗（如肝癌細胞活力測定、傷口愈合測定、細胞侵襲測定）和小鼠試驗（如成瘤小鼠體內上下游分子機制、敲低或者過表達LncRNA后肝癌的生長速度及侵襲范圍的變化的研究）進行驗證。

綜上所述，本文構建了一個銅死亡相關LncRNA的預后模型。該模型與HCC患者的腫瘤免疫細胞浸潤和免疫應答密切相關，可有效預測患者的預后及免疫治療療效，為臨床個體化治療提供堅實的理論支持。

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